Avaliação do potencial antitumoral da lectina de Canavalia grandiflora (ConGF) em culturas de células de glioma da linhagem C6

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2018.Glioblastomas (GBMs) são tumores malignos altamente agressivos, de ocorrência no sistema nervoso central. O prognóstico dos pacientes com GBM é desfavorável, principalmente por ser um câncer muito resistente às terapias atuais; além de sua natureza invasiva. Uma característica que tem sido associada à transformação maligna e progressão do tumor é a presença de alterações no padrão de glicosilação celular. Lectinas são proteínas de reconhecimento e ligação a carboidratos presentes em glicoconjugados, podendo regular numerosos processos celulares em eventos fisiológicos e patológicos. ConA, por exemplo, é uma lectina com afinidade por glicose/manose que demonstrou ter atividade antitumoral, sendo capaz de desencadear uma sinalização pró-apoptótica e autofágica. ConGF é uma lectina isolada das sementes de Canavalia grandiflora, que de maneira similar à ConA possui afinidade por glicose/manose. Apesar de ter a mesma afinidade e semelhança estrutural a ConA, nenhum estudo prévio avaliou o efeito de ConGF sobre GBMs. Neste sentido, o presente estudo teve como objetivo investigar o potencial antitumoral de ConGF sobre a linhagem C6, bem como os mecanismos de morte celular implicados. Nossos resultados mostraram que ConGF (30-100 µg/mL) reduziu a viabilidade celular (avaliada pelo ensaio de MTT) e induziu alterações morfológicas (avaliadas por microscopia de luz e de fluorescência) nas células da linhagem C6. Adicionalmente, ConGF foi efetiva em inibir a taxa de proliferação das células C6, além de afetar o potencial transmembrana mitocondrial, um processo que pode estar associado com a indução de apoptose. Ensaios de bloqueio do domínio de interação com carboidratos (CRD) demonstraram que a ação de ConGF foi dependente do CRD; uma vez que a ConGF não teve efeito biológico após sua pré-incubação com a-metil-D-manosídeo (um bloqueador do CRD). A análise de migração celular mostrou que o tratamento com ConGF, em baixas concentrações (25 ou 30 µg/mL) foi efetivo em promover a inibição da migração celular. Além disso, o tratamento com ConGF foi capaz de induzir o processo de autofagia na linhagem C6, avaliado através da coloração com laranja de acridina (LA) e pela avaliação da expressão da proteína recrutada durante a autofagia (LC3AB-II) nas células tratadas com ConGF (30 µg/mL). Dessa forma, podemos concluir que ConGF apresentou uma potente atividade antitumoral in vitro e este efeito pode estar relacionado com a indução do processo de autofagia. O presente estudo indica pela primeira vez o potencial antitumoral de ConGF e aponta a importância de estudos adicionais para detalhar o mecanismo de ação desta lectina.Abstract : Glioblastoma (GBM) are malignant tumors considered as the most aggressive occurring in the central nervous system. The prognosis of patients with GBM is poor, mainly because it is a very resistant cancer to currently used therapies; beyond their invasive nature. One characteristic that has been associated with the malignant transformation and tumor progression is the presence of changes in the pattern of cellular glycosylation. Lectins are carbohydrate recognition and binding proteins present in glycoconjugates, being able to regulate numerous cellular processes in physiological and pathological events. ConA, for example, is a lectin with mannose/glucose-binding specificity that showed antitumor activity; being able to trigger pro-apoptotic and autophagic signalings. In turn, ConGF is a mannose/glucose-binding lectin isolated from Canavalia grandiflora seeds which, likewise ConA, display mannose/glucose-binding affinity. Despite such similarities, no previous study evaluated the effect of ConGF on GBM. Therefore, the present study aimed to investigate the antitumor capacity of ConGF on C6 cell line, as well as evaluate possibles mechanisms implicated in this effect. Our results showed that ConGF (30-100µg/mL) reduced cell viability (measured by the MTT assay) and induced morphological changes (assessed by optic and fluorescence microscopy) on C6 cells. Additionally, ConGF was effective in inhibiting the proliferation rate of C6 cells, and also affected the mitochondrial membrane potential, which might be associated with apoptosis induction. Moreover, assay that blocked the carbohydrate recognition domain (CRD) demonstrated that ConGF-induced cell death was dependent on CRD; since ConGF had no biological effect after its preincubation with a-methyl-D-mannoside (a CRD blocker). Cell migration assay showed that the treatment with ConGF at low concentrations (25 or 30 µg/mL) was effective in promoting the inhibition of cell migration. In addition, ConGF treatment was able to induce autophagic process, evaluated by the acridine orange (AO) stain, as well as by measurement of LC3AB-II expression, a protein recruited and activated during autophagy. Thus, we can conclude that ConGF showed potent antitumor activity in vitro, and this effect may be related to the induction of the autophagic process. The present study indicates for the first time the antitumor capability of ConGF and indicates the importance of further studies addressing the mechanism triggered by ConGF for this action