Resíduos reativos de cisteína: estudos químico-biológicos em proteínas

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2022.Em meio aos vinte aminoácidos proteinogênicos, as cisteínas se destacam por apresentarem propriedades químicas singulares. A presença do átomo de enxofre em sua cadeia lateral confere às cisteínas um caráter nucleofílico e redox ativo, tornando esses aminoácidos particularmente reativos em sistemas biológicos. Essa reatividade se reflete em diversas funções desempenhadas por cisteínas em proteínas. Dentre essas, se destacam o seu papel catalítico e regulatório, como sensor de espécies reativas oxidantes e eletrofílicas. Essa versatilidade química e funcional faz das cisteínas um alvo de particular interesse para técnicas de modificação química de proteínas. A modificação química de proteínas, ou mutagênese pós-expressão, consiste no uso de reações químicas para modificar resíduos de aminoácidos em cadeias polipeptídicas, após o processo de tradução. Assim, a mutagênese pós-expressão consiste em uma forma de edição química e figura como uma alternativa às técnicas de biologia molecular para alterar as propriedades funcionais das proteínas. Nesse âmbito, o presente trabalho teve por objetivo explorar a reatividade e funcionalidades dos resíduos de cisteína em um contexto de química biológica, envolvendo a modificação química de proteínas. O primeiro capítulo consiste em uma revisão bibliográfica acerca do uso de modificações químicas, em proteínas nativas, no desenvolvimento de novos biocatalisadores. Além de um breve histórico, são discutidas as principais formas de se modificar aminoácidos canônicos intrinsicamente reativos (cisteína, lisina, a extremidades amino-terminal e os carboxilatos) e as possíveis aplicações biotecnológicas dessas modificações. No segundo capítulo descreve-se o uso de técnicas de mutagênese pós-expressão para investigar os efeitos da inserção de aminoácidos não canônicos em um resíduo de cisteína de uma proteína modelo nativa, a Proteína Tirosina Fosfatase A de Mycobacterium tuberculosis. A conversão do resíduo exposto de Cys53 em deidroalanina foi o ponto para a inserção de cadeias laterais não canônicas, pela adição de nucleófilos de enxofre e nitrogênio. As proteínas modificadas apresentaram atividade catalítica alterada e reforçam o papel regulatório do resíduo de Cys53, demonstrado anteriormente por nosso grupo de pesquisa. No terceiro capítulo descreve-se o projeto de pesquisa desenvolvido durante o período de doutorado sanduíche, no âmbito do programa CAPES-PrInt. Nesse capítulo relatou-se a síntese de novos antibióticos N-tio-ß-lactâmicos, seu mecanismo de ação e atividade antimicrobiana. Esses compostos se revelaram inibidores covalentes da enzima L,D-Transpeptidase 2 de M. tuberculosis. Dados estruturais e de espectrometria de massas revelam um mecanismo de inibição envolvendo o bloqueio do sítio ativo pela formação de um aduto molecular estável no resíduo catalítico de cisteína. Dois dos compostos mais potentes apresentaram atividade antimicrobiana contra isolados clínicos multirresistentes de M. tuberculosis. Por fim, o desenvolvimento desse trabalho permite confirmar a versatilidade dos resíduos de cisteína como ponto de partida para estratégias de modificação química de proteínas. O trabalho também permitiu concluir que essas abordagens podem ser utilizadas tanto para o estudo da funcionalidade das proteínas, no âmbito da pesquisa básica, como também apresentam uma importante aplicabilidade biotecnológica e biomédica, no desenvolvimento de novos produtos para a indústria e de novas moléculas terapêuticas.Abstract: Cysteines stand out from other proteinaceous amino acids due to their singular chemical properties. Harboring a sulfur atom in their sidechains, the thiol group form cysteines is nucleophilic, redox active and very reactive in biological systems. This reactivity translates into various functions displayed by cysteine residues in proteins. Among them, of our particular interest, is the catalytic and regulatory role as a sensor for oxidative and electrophilic reactive species. Their chemical and functional versatility make cysteines a particularly interesting target for the chemical modification of proteins. Protein chemical modifications, or post-expression mutagenesis, consists of using chemical reactions to modify amino acid residues in translated polypeptide chains. Thus, post-expression mutagenesis is a form of chemical editing that represents an alternative to molecular biology techniques in altering the functional properties of proteins. In this context, this work aims to explore the reactivity and functions of cysteine residues within a chemical biology framework related to protein chemical modifications The first chapter consists of a review article dedicated to the application of chemical modification of proteins in the development of novel biocatalysts. Including a brief historical background, this review mainly discusses the available methods to modify reactive canonical amino acids (cysteines, lysines, the N-terminus and carboxylates) and the biotechnological applications of these modifications. The second chapter describes the use of post-expression mutagenesis to promote the introduction of non-canonical amino acids to a native protein model, the Protein Tyrosine Phosphatase A, from Mycobacterium tuberculosis. Conversion of the Cys53 residue to dehydroalanine was the starting point to the insertion of non-canonical sidechains through the conjugate addition of N and S-nucleophiles. Modified proteins displayed altered enzyme activity which further validate the regulatory role of Cys53, previously demonstrated by our research group. The third chapter describes the research project developed during an exchange period, funded by the CAPES-PrInt program. This chapter reports the synthesis, mechanism of action and antimicrobial activity of novel N-thio-ß-lactam compounds. These molecules are covalent inhibitors of the enzyme L,D-Transpeptidase 2, from M. tuberculosis. Structural and mass spectrometry data support inactivation by the formation of a stable molecular adduct at the active site cysteine. The most potent compounds displayed antimicrobial activity against resistant clinical isolates of M. tuberculosis. Finally, the development of this work confirms the versatility of cysteine residues as initial targets for protein modification strategies. This work also concludes that these approaches can be used for the study of protein functionality, within the framework of basic research, but also have important biotechnological and biomedical applicability in terms of the development of new products for industry and novel therapeutical molecules