Ação antitumoral das lectinas DrfL I e ConBr via ativação de caspases e autofagia: potencial aplicação em estudos e terapia de gliomas

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2021.O glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo de glioma mais agressivo. As células de GBM caracterizam-se por apresentarem habilidade de autorenovação e características de células indiferenciadas, conjuntamente com habilidades de ativação de mecanismos de resistência a temozolomida (TMZ ? quimioterápico de escolha frente ao GBM) e a radioterapia. O padrão de glicosilação atípico das células tumorais promove ativação de vias de sinalização envolvidas na migração, invasão e proliferação celular. Essas características do tumor, associada à limitada eficiência dos quimioterápicos disponíveis e seus efeitos colateriais, fazem que o prognóstico clínico do GBM seja desfavorável. As lectinas são proteínas que reconhecem e ligam-se reversivelmente a glicanos específicos da superfície celular apresentando inúmeros efeitos biológicos. Nos últimos anos houve um aumento nos estudos de lectinas obtidas de plantas, com destaque nas propriedades antitumorais. O objetivo desse trabalho foi demonstrar a capacidade antitumoral das lectinas isoladas de sementes de leguminosas Dioclea reflexa (DrfL I) e Canavalia brasiliensis (ConBr) sobre culturas celulares de glioma. Nossos resultados demostraram que ambas lectinas induziram alterações morfológicas e efeitos citotóxicos sobre culturas de células de glioma das linhagens C6, U-87 MG e GBM1. A ação das lectinas foi dependente da interação com glicanos, sendo o efeito citotóxico aparentemente seletivo para as células tumorais, não alterando a viabilidade e morfologia de astrócitos mantidos em cultura primária. DrfL I e ConBr causaram inibição da migração, adesão, proliferação e sobrevivência das células tumorais, sendo estes efeitos acompanhados da ativação das MAPKs (p38 e JNK (p46/54)), juntamente com inibição de Akt, mTORC1 e a MAPK (ERK1/2). O processo de autofagia foi ativado nas células de GBM, destacado pelo aumento do número de organelas vesiculares ácidas e clivagem da LC3 (Cadeia leve 3 da Proteína 1 associada a Microtúbulos, um marcador de carga do autofagossomo). O inibidor autofágico, 3-methyl-adenine (3-MA), inibiu parcialmente o efeito citotóxico das lectinas. Notavelmente, os inibidores de caspase-8 (IETF-fmk) e JNK (SP600125) conseguiram atenuar a morte celular nas células de GBM tratadas com as lectinas. O tratamento combinado das lectinas com TMZ não promoveu incremento da ação antitumoral quando comparado aos tratamentos individuais. Da mesma forma não acarretaram efeitos aditivos ou sinérgicos sobre a sinalização de MAPKs e Akt. Em síntese, os nossos resultados indicam que as lectinas requerem um domínio de ligação à carboidratos para exercer sua ação antiglioma; a citotoxicidade destas proteínas parece estar associada à ativação do processo de autofagia e ser dependente da ativação de caspase-8. Além disso, pode envolver de forma complexa a modulação das vias de MAPKs e Akt/mTORC1.Abstract: Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive type of glioma. GBM cells are characterized by their ability to self-renew and have features of undifferentiated cells, together with the ability to activate mechanisms of resistance to temozolomide (TMZ ? the standard chemotherapy agent used as treatment of GBM) and radiotherapy. The atypical glycosylation pattern of tumor cells promotes activation of signaling pathways involved in cell migration, invasion and proliferation. These tumor characteristics, associated with the limited efficiency of available chemotherapies and their side effects, make the clinical prognosis of GBM unfavorable. Lectins are proteins that recognize and bind reversibly to specific glycans on the cell surface, presenting numerous biological effects. In recent years there has been an increase in the studies of lectins obtained from plants, with emphasis on antitumor properties. The objective of this work was to demonstrate the antitumor capacity of lectins isolated from the seeds of the legumes Dioclea reflexa (DrfL I) and Canavalia brasiliensis (ConBr) on glioma cell cultures. Our results demonstrated that both lectins induced morphological changes and cytotoxic effects on glioma cell cultures of C6, U-87 MG and GBM1 cell lines. The action of the lectins was dependent on the interaction with glycans, and the cytotoxic effect was apparently selective for tumor cells, not altering the viability and morphology of astrocytes maintained in primary culture. DrfL I and ConBr caused inhibition of tumor cell migration, adhesion, proliferation and survival, and these effects were accompanied by activation of MAPKs (p38 and JNK (p46/54)), along with inhibition of Akt, mTORC1 and the MAPK (ERK1/2). The autophagy process was activated in GBM cells, highlighted by increased numbers of acidic vesicular organelles and cleavage of LC3 (Light chain 3 of Microtubule-associated Protein 1, a marker of autophagosome). The autophagic inhibitor, 3-methyl-adenine (3-MA), partially inhibited the cytotoxic effect of lectins. Notably, the caspase-8 (IETF-fmk) and JNK (SP600125) inhibitors were able to attenuate cell death in GBM cells treated with the lectins. The combined treatment of lectins with TMZ did not promote increased antitumor action when compared to individual treatments. Moreover, they did not entail additive or synergistic effects on MAPKs and Akt signaling. In summary, our results indicate that lectins require a carbohydrate-binding domain to exert their antiglioma action; the cytotoxicity of these proteins seems to be associated with the activation of the autophagy process and to be dependent on the activation of caspase-8. In addition, it may involve in a complex way the modulation of MAPKs and Akt/mTORC1 pathways