Prospecção e caracterização molecular de novas defensinas do tipo CSaß (Cg-Defs) e big defensinas (Cg-BigDefs) na ostra Crassostrea gigas

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2020.As defensinas são um dos peptídeos antimicrobianos (AMPs) mais abundantes e bem distribuídos entre os seres vivos. Elas compreendem famílias multigênicas de peptídeos estabilizados por ligações dissulfeto e que apresentam atividade antimicrobiana contra um amplo espectro de microrganismos. Ostras Crassostrea gigas são organismos extremamente polimórficos e que possuem uma vasta diversidade de AMPs, incluindo defensinas do tipo CSaß e big defensinas. Embora possuam funções análogas, essas defensinas não são filogeneticamente relacionadas. Nesse contexto, o presente estudo investigou a diversidade molecular de defensinas do tipo CSaß (Cg-Defs) e big defensinas (Cg-BigDefs) em C. gigas. Por meio de buscas in silico, duas novas defensinas do tipo CSaß (nomeadas Cg-Defh3 e Cg- Defh4) e três big defensinas (nomeadas Cg-BigDef4, Cg-BigDef5 e Cg-BigDef6) foram encontradas em C. gigas. As duas novas Cg-Defs apresentam um peptídeo sinal, seguido de um pró-domínio e de um peptídeo maduro estabilizado por três ligações dissulfeto, possuindo uma alta identidade aminoacídica com defensinas do tipo CSaß de insetos. Além disso, as Cg-Defh3 e Cg-Defh4 são as primeiras defensinas de caráter aniônico identificadas em C. gigas. As três novas sequências de big defensinas são compostas por um peptídeo sinal, seguido de um pró- domínio e de um peptídeo maduro, possuindo a mesma assinatura molecular encontrada nas demais Cg-BigDefs. Ademais, os resultados também revelaram que as novas Cg-Defs e Cg- BigDefs apresentaram uma expressão muito baixa, ou até mesmo ausente, ainda que após a infecção experimental por patógenos de interesse aquícola. Esse resultado está possivelmente relacionado ao fato dessas defensinas estarem sujeitas ao fenômeno genético de PAV (gene presence/absence variation), no qual um gene está presente em alguns, mas não em todos os indivíduos de uma mesma espécie. Em conjunto, os resultados demonstram que as defensinas de C. gigas são altamente diversas em nível de sequências, variedade de assinaturas moleculares e características bioquímicas, abrindo assim perspectivas para estudos futuros que elucidem a participação desses efetores na imunidade de moluscos bivalves.Abstract: Defensins are one of the most abundant and well-distributed antimicrobial peptides (AMPs) among living organisms. They comprise multigenic families of disulfide-stabilized peptides that exhibit antimicrobial activity against a wide spectrum of microorganisms. Crassostrea gigas oysters are highly polymorphic organisms showing a broad diversity of AMPs, including both CSaß-containing defensins and big defensins. Although they have analogous functions, these defensins are not phylogenetically related. In this regard, the present study investigated the molecular diversity of CSaß-containing defensins (Cg-Defs) and big defensins (Cg- BigDefs) in C. gigas. By using in silico searches, two novel CSaß-containing defensins (named Cg-Defh3 and Cg-Defh4) and three big defensins (named Cg-BigDef4, Cg-BigDef5 and Cg- BigDef6) were found in C. gigas. The two Cg-Defs possess a signal peptide, followed by a pro- domain and a mature peptide stabilized by three disulfide bonds, and showed a high amino acid identity with insect CSaß-containing defensins. Moreover, Cg-Defh3 and Cg-Defh4 are the first anionic defensins to be identified in C. gigas. The three novel big defensins have a signal peptide, followed by a pro-domain and a mature peptide, and show the same molecular signature found in the other Cg-BigDefs. In addition, results revealed that the novel Cg-Defs and Cg-BigDefs showed a very low or, even absent, gene expression, even after an experimental infection with pathogens of aquaculture interest. This result is probably related to the fact that these defensins can be affected by the genetic phenomenon of PAV (gene presence/absence variation), in which a gene is present in some, but not in all individuals belonging to the same species. Altogether, results showed that defensins from C. gigas are highly diverse in sequences, molecular signatures and biochemical features, opening new perspectives for further studies on the participation of these effectors in the immunity of bivalve mollusks