Otimização da produção de fucoxantina pela diatomácea Phaeodactylum tricornutum: análise computacional associada a cultivos in vitro

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2020.Apesar dos desenvolvimentos da síntese química, a importância do estudo e utilização de produtos naturais é inquestionável, em parte devido aos efeitos nem sempre seguros dos compostos sintéticos e ao tempo necessário à comprovação de sua eficácia, que elevam os custos de produção. Neste contexto, organismos marinhos são alvos crescentes de estudos na procura por compostos bioativos, visto serem os oceanos ambientes pouco explorados do ponto de vista da investigação científica e da prospecção de biomoléculas. Neste contexto, este estudo se volta à produção de fucoxantina, um oxicarotenoide com importantes atividades biológicas relatadas, e.g., termogênica e antitumoral, pela microalga marinha Phaeodactylum tricornutum, uma espécie reconhecida por seu potencial de produção deste metabólito secundário. Para realização deste trabalho, fez-se uso de ferramentas de bioinformática, a fim de possibilitar a simulação de fenótipos in silico, bem como de técnicas de cultivo in vitro, visando a busca por elicitores à produção otimizada de fucoxantina, além da obtenção deste carotenoide com alto grau de pureza. Em uma primeira etapa (Capítulo I), uma revisão na literatura do estado da arte à produção de fucoxantina por P. tricornutum revelou que são poucos os dados disponíveis no que se refere ao efeito de nutrientes, principalmente N e P, na produção daquele oxicarotenoide e na captação de carbono. Ainda com relação ao metabolismo, as vias responsáveis pela carotenogênese não encontram-se totalmente elucidadas. Na segunda etapa do estudo (Capítulo II), fez-se uso de ferramentas computacionais à construção de modelos metabólicos otimizados à obtenção do pigmento de interesse. Dois modelos computacionais para o metabolismo de P. tricornutum foram identificados e posteriormente aprimorados, através de pesquisa por reações das vias responsáveis pela carotenogênese, seguido da simulação de fenótipos utilizando software dedicado. Como resultado das simulações, dezesseis enzimas-chave dos metabolismos de N, da glicólise e da fotossíntese foram detectadas, cuja regulação resulta no potencial incremento da biossíntese de fucoxantina na espécie. Na terceira etapa do estudo (Capítulo III), buscou-se aplicar in vitro as condições apontadas pelo modelo in silico para aumento da biomassa, i.e., aplicação de ureia, que resultou em aumento na produção de biomassa (43%) na maior concentração de ureia testada (10mM), e um aumento na produção de fucoxantina (35%) na menor concentração de ureia (0,44mM). Além disto, uma busca por inibidores das enzimas detectadas nos modelos computacionais de simulação fenotípica foi realizada, seguido da análise de seus efeitos na biossíntese de fucoxantina em sistemas de cultivo celular de P. tricornutum. Dos inibidores testados, e.g., prednisolona (0,26mM), piruvato de sódio (0,5mM), piridoxal (62µM), carbonato de dietila (1mM), EDTA dissódico (0,5mM), sulfato de cobre (0,5mM), fosfato de potássio (2,5mM), sulfato de amônio (0,5mM) e quercetina (0,1mM), somente os dois últimos estimularam a síntese de fucoxantina em 106% e 89% a mais que o controle respectivamente. Numa abordagem complementar, testes à biossíntese de fucoxantina foram conduzidos, considerando-se a exposição dos cultivos celulares à radiação na faixa do azul. Os valores de radiação utilizados (60, 120 e 60 µmol fotons m -2 s -1 ) para radiações nas faixas branco, branco e azul e somente azul, respectivamente, não estimularam a biossíntese de fucoxantina. Como etapa subsequente do estudo, buscando obter fucoxantina isolada e com alto grau de pureza, utilizou-se a técnica de cromatografia em coluna aberta de sílica, recuperando e purificando o pigmento a partir de biomassa microalgal com maior valor de rendimento, consoante à indicação dos modelos metabólicos desenvolvidos in silico. Foi possível recuperar após este processo 24,77 mg.g ¯ 1 MS de fucoxantina, valor que corresponde a 62% da fucoxantina disponível nos extratos brutos de P. tricornutum cultivados com sulfato de amônio (0,5mM). Os resultados concordam qualitativamente com os modelos metabólicos em pelo menos uma das concentrações testadas para o aumento da biomassa com utilização de ureia como fonte de nitrogênio. Foi também possível aumentar a produção de fucoxantinaem P. tricornutum quando do fornecimento de ureia e sulfato de amônio respectivamente. Desta forma, os modelos computacionais aqui utilizados trouxeram resultados positivos para maior produção de fucoxantina em P. tricornutum. Também foi possível purificar a fucoxantina de extratos brutos de P. tricornutum através das técnicas cromatográficas aqui utilizadas obtendo-se valores significativos com relação a outros encontrados na literatura para esta microalga.Abstract: Despite the developments of chemical synthesis, the importance of the study and use of natural products is of utmost importance, partly due to the side effects of synthetic compounds and also to the time needed to prove their efficacy, which increase production costs. In this context, marine organisms are an increasing target of studies in the search for bioactive compounds, since the oceans are poorly exploited from the point of view of scientific research and biomolecule prospection. In this context, this study turns to the production of fucoxanthin, an oxycarotenoid with important biological activities reported, e.g., thermogenic and antitumoral, by the marine microalga Phaeodactylum tricornutum, a species recognized for its potential of production of that secondary metabolite. In order to perform this work, bioinformatics tools were adopted to simulate in silico phenotypes with superior amounts of fucoxanthin, in connection with in vitro cell cultures, aiming to identify elicitor compounds of the fucoxanthin biosynthesis pathway. In a first step (Chapter I), a review of literature regarding the state of the art on the production of fucoxanthin by P. tricornutum has revealed that few data are available for the effect of nutrients, mainly nitrogen and phosphorus, on the production of that pigment and carbon assimilation. Also with regard to metabolism, the carotenogenic pathways are still not well known. In the second stage (Chapter II), computational tools were used to construct optimized metabolic models to obtain the pigment of interest. Two computational models for the metabolism of P. tricornutum were identified and later improved through research on the pathways responsible for carotenogenesis, followed by phenotype simulation using dedicate software for phenotype simulation. As a result, sixteen key enzymes of N metabolism, glycolysis, and photosynthesis were detected, with potential to increase the biosynthesis of fucoxanthin in the species through its regulation. In the third stage of the study (Chapter III), in vitro conditions were simulated in order to increase biomass, i.e., application of urea, which resulted in an increase in the production of biomass (43%) with the highest concentration of urea tested (10mM), and an increase in the production of fucoxanthin (35%) with the lowest concentration of urea (0.44mM). In addition, a search for enzyme inhibitors detected in the phenotype simulations of the computational models was carried out, followed by the analysis of their effects on fucoxanthin biosynthesis in P. tricornutum cell cultures. Of the inhibitors tested, i.e., prednisolone (0.26mM), sodium pyruvate (0.5mM), pyridoxal (62µM), diethyl carbonate (1mM), disodium EDTA (0.5mM), copper sulfate (0.5mM) , potassium phosphate (2.5mM), ammonium sulfate (0.5mM) and quercetin (0.1mM), only the last two stimulated the synthesis of fucoxanthin, i.e., 106% and 89% more than control respectively. In a complementary approach, tests for fucoxanthin biosynthesis were conducted, considering the exposure of cell cultures to radiation in the blue band. The radiation values used (60, 120 and 60 µmol photons m -2 s -1 ) for radiation at white, white and blue and only blue bands, respectively, did not stimulate fucoxanthin biosynthesis. As a subsequent stage of this study, seeking to obtain isolated fucoxanthin with a high degree of purity, the technique of silica open column chromatography was used, recovering and purifying the pigment from microalgal biomass with higher yield, according the indication of metabolic models developed in silico. It was possible to recover after this process 24.77 mg.g- 1 DM fucoxanthin, a value that corresponds to 62% of the fucoxanthin available in the crude extracts of P. tricornutum grown with ammonium sulfate (0.5mM). The results agree qualitatively with the metabolic models in at least one of the concentrations tested to increase biomass using urea as a nitrogen source. It was also possible to increase the production of fucoxanthin in P. tricornutum using urea and ammonium sulphate, respectively. Thus, the computational models used in this study brought positive results for greater production of fucoxanthin in P. tricornutum. It was also possible to purify fucoxanthin from crude extractsof P. tricornutum by means of the chromatographic techniques used here, obtaining significant values in relation to others found in the literature for this microalgae