Efeitos da sobre-expressão dos genes TPO2 e TPO3 na tolerância ao ácido acético em linhagem industrial recombinante de Saccharomyces cerevisiae

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2019.Os genes TPO2 e TPO3 têm sido descritos na literatura como um dos principais genes envolvidos na tolerância da levedura Saccharomyces cerevisiae ao ácido acético. Ambos os genes codificam transportadores multidrogas supostamente responsáveis por bombear ânions acetato do interior para o exterior celular, durante o período de adaptação da levedura ao ácido. O composto, apesar de ser naturalmente metabolizado pela levedura S. cerevisiae, pode ser encontrado em altas concentrações nos hidrolisados lignocelulósicos destinados à produção de etanol de segunda geração (2G), agindo como um potente inibidor metabólico. Logo, aumentar a tolerância da espécie ao ácido acético é essencial para a indústria do álcool 2G. No presente trabalho, os genes TPO2 e TPO3 de uma linhagem industrial de S. cerevisiae foram colocados sob o controle do promotor constitutivo PADH1, para verificar se a sobre-expressão desses genes aumentaria a tolerância da linhagem ao inibidor. Os efeitos das modificações realizadas foram inicialmente analisados em ensaios de crescimentos em microescala, utilizando-se meio mínimo acrescido de 20 g.L-1 de xilose/glicose e 0-6 g.L-1 de ácido acético. Enquanto a linhagem criada para sobre-expressar o gene TPO2 (BRY-TPO2M) não teve sua tolerância ao ácido modificada, a linhagem criada para sobre-expressar o gene TPO3 (BRY-TPO3M) teve a sua tolerância reduzida de 3,6 g.L-1 de ácido acético para 2,4 g.L-1. De forma similar, quando crescida em condições de alta aeração, a linhagem BRY-TPO3M apresentou maior dificuldade de se adaptar à presença de 2,4 g.L-1 do ácido acético, do que a sua linhagem parental. Para investigar se a baixa tolerância ao inibidor apresentada pelas linhagens criadas poderia estar associada à falha na sobre-expressão proposta para os genes TPO2 e TPO3, o nível de expressão relativa de ambos os genes foram quantificados por qRT-PCR. As análises foram realizadas utilizando-se tanto RNA total extraído de células pré-crescidas em meio controle, quanto de células pré-crescidas em meio contendo o ácido. No primeiro caso, os dados obtidos confirmaram a sobre-expressão dos genes TPO2 e TPO3 nas linhagens recombinantes, cuja expressão ficou cerca de 9 vezes acima daquelas observadas para a linhagem parental. Para a nossa surpresa, no entanto, as análises utilizando RNA total extraído de células pré-crescidas em meio contendo ácido acético, mostraram que a funcionalidade do promotor PADH1 foi inibida pela presença do inibidor. Como consequência, na presença de ácido acético, as modificações genéticas realizadas nas linhagens recombinantes, ao invés de aumentarem a expressão dos genes-alvo, conforme originalmente proposto, diminui-as. Dentro dessa perspectiva, concluiu-se que enquanto a menor expressão do gene TPO2 não afetou a tolerância de S. cerevisiae ao ácido acético, a menor expressão do gene TPO3 causou uma maior dificuldade da espécie de se adaptar à presença do inibidor. A maior dificuldade da levedura de se adaptar ao composto, reforçou a ideia de que a sobre-expressão, pelo menos do gene TPO3, pode ser uma estratégia interessante para aumentar a tolerância da espécie ao ácido acético.Abstract : The TPO2 and TPO3 genes have been described as two major genes involved in Saccharomyces cerevisiae tolerance to acetic acid. Both genes encode multidrug transporters that carry acetate out of the cell during yeast adaptive response to acidic stress. Acetic acid, besides being a normal yeast metabolite, can be present at high concentrations in lignocellulosic hydrolysates destined to 2G ethanol production acting as a yeast growth inhibitor. Thus, increasing S. cerevisiae tolerance to acetic acid is a paramount to the 2G ethanol industry. In order to investigate if over-expression of the TPO2 and TPO3 genes could increase the yeast tolerance to acetic acid, the present study placed both genes of an industrial recombinant S. cerevisiae strain under the control of the constitutive promoter PADH1. The effects of such genetic modifications were initially analysed through micro growth assays performed with synthetic medium containing 20 g.L-1 of xylose/glucose and 0-6 g.L-1 of acetic acid. While the strain created to over-express the TPO2 gene (BRY-TPO2M) did not show any acetic acid tolerance difference from its parental strain, the strain constructed to over-express the TPO3 gene (BRY-TPO3M) showed a tolerance reduction from 3,6 g.L-1 to 2,4 g.L-1 of acetic acid. Similarly, when grown under high aeration conditions, the BRY-TPO3M strain had greater difficulty adapting to 2,4 g.L-1 of acetic acid than its parental strain. To investigate if the stains lower acetic acid tolerance could be associated with a failed TPO2 and TPO3 over-expression, both genes had their relative expression analysed by qRT-PCR. Total RNA extracted from yeast cells pre-grown in control media, and total RNA extracted from yeast cells pre-grown in the presence of acetic acid were used. In the first case, our results confirmed over-expression of TPO2 and TPO3 genes in recombinant strains created. In contrast to parental strain, recombinant strains showed each gene being 9x more expressed. To our surprise, however, when we used total RNA extracted from yeast cells pre-grown in acetic acid, it was clear that the acetic acid presence inhibited the PADH1 promoter used to over-express the target genes. Accordingly, it was found that genetic modification carried out in recombinant strains, instead of increasing the expression levels of both target genes, decreased them when acetic acid was present in the media. From this perspective, we concluded that the lower TPO2 gene expression did not decrease S. cerevisiae tolerance to acetic acid, while lower TPO3 expression caused a greater difficulty for the specie to become adapted to the inhibitor. Besides, the idea that over-expressing the TPO3 gene could be an interesting strategy to increase S. cerevisiae acetic acid tolerance was reinforced