Investigação do envolvimento do óxido nítrico e do transporte de lactato sobre os efeitos neuroprotetores da guanosina em um modelo in vitro de isquemia cerebral

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2020.As doenças vasculares cerebrais isquêmicas representam uma importante causa de mortalidade e de morbidade no Brasil e no mundo. A interrupção do fluxo sanguíneo ocasiona o bloqueio da entrega de oxigênio e glicose, entre outros metabólitos para o encéfalo, resultando na falha energética celular. A ruptura do metabolismo cerebral é o ponto chave do processo isquêmico, ativando vias bioquímicas e moleculares que resultam em danos celulares. A excitotoxicidade glutamatérgica, o estresse oxidativo e a falha energética desempenham importantes papéis durante a isquemia. Nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa tem estudado os efeitos da guanosina, um nucleosídeo endógeno derivado da guanina, como agente protetor frente a diversas patologias do sistema nervoso central. Uma das principais ações deste nucleosídeo ocorre a partir de sua ligação com os receptores adenosinérgicos, resultando na modulação da transmissão glutamatérgica e, consequentemente, impedindo o desenvolvimento da excitotoxicidade por glutamato. Neste trabalho, buscamos investigar o envolvimento do óxido nítrico e do transporte de lactato sobre os efeitos promovidos pela guanosina em fatias de hipocampo de ratos submetidas à privação de glicose e oxigênio seguida por reoxigenação. Demonstramos que a guanosina (100 µM) e o inibidor das enzimas óxido nítrico sintases (L-NAME, 1 mM) promoveram proteção celular, restauraram os níveis de ATP, de lactato e estimularam a captação de glutamato. Por outro lado, a presença de moléculas doadoras de óxido nítrico (DETA-NO, 800 µM ou SNP, 5 µM) impediram os efeitos protetores da guanosina. Estes resultados apontam para um mecanismo de proteção da guanosina envolvendo a diminuição da síntese de óxido nítrico e prevenindo o estresse oxidativo. Ainda, observamos que a presença de 4-CIN (500 µM), um inibidor não-seletivo dos transportadores monocarboxílicos ou TBOA (10 µM), um inibidor não-seletivo dos transportadores glutamatérgicos, preveniram os efeitos protetores da guanosina sobre a restauração dos níveis de ATP, de lactato e sobre a captação de glutamato. A presença de DHK (100 µM), um inibidor dos transportadores gliais de glutamato GLT-1, inibiu parcialmente os efeitos da guanosina sobre os mesmo parâmetros citados anteriormente. Mostramos que a guanosina restaurou o dano isquêmico sobre a respiração celular e que este efeito não foi prevenido pela presença de 4-CIN. Por fim, corroboramos que os efeitos da guanosina são dependentes dos receptores A1 e A2A de adenosina. Resumidamente, demonstramos que a guanosina modulou não somente os transportadores de glutamato, mas, provavelmente a atividade dos transportadores de monocarboxilatos, possibilitando o transporte de lactato a fim de manter os níveis de ATP, a viabilidade e a respiração celular em fatias de hipocampo de ratos submetidas a um protocolo in vitro de isquemia cerebral.Abstract: Ischemic cerebrovascular diseases represent a major cause of mortality and morbidity worldwide, as also in Brazil. The blockade of blood flow causes an interruption in the delivery of oxygen and glucose, amongst other metabolites to the brain, resulting in cellular energy failure. Disruption of brain energy metabolism is a key point of the ischemic process, which leads to the activation of biochemical and molecular pathways, resulting in cell damage. Glutamatergic excitotoxicity, oxidative stress, and energy failure play important roles during ischemia. Our research group has studied the effects of guanosine, an endogenous nucleoside derived from guanine, as a protective agent against several pathologies of the central nervous system. One of the main actions of this nucleoside occurs from its binding to adenosine receptors, resulting in the modulation of glutamatergic transmission and, consequently, preventing glutamate excitotoxicity development. In this work, we investigate the involvement of nitric oxide and lactate transport on the effects promoted by guanosine in hippocampal slices of rats subjected to glucose and oxygen deprivation followed by reoxygenation. We demonstrated that guanosine (100 µM) and the pan-inhibitor of nitric oxide synthase enzymes (L-NAME, 1 mM) promoted cell protection, restored ATP and lactate levels, and recovered glutamate uptake. On the other hand, the presence of nitric oxide donor molecules (DETA-NO, 800 µM, or SNP, 5 µM) prevented the guanosine protective effects. These results indicate that guanosine protection mechanisms may involve the reduction of nitric oxide synthesis, thus preventing oxidative stress. Furthermore, the presence of 4-CIN (500 µM), a non-selective inhibitor of monocarboxylic transporters, or TBOA (10 µM), a non-selective inhibitor of glutamatergic transporters, prevented the guanosine protective effects on the restoration of ATP and lactate levels, as well as upon the glutamate uptake. The presence of DHK (100 µM), an inhibitor of the glial GLT-1 glutamate transporter, partially inhibited the guanosine effects on the parameters mentioned above. We have shown that guanosine restores ischemic damage upon cellular respiration and that this effect was not prevented by 4-CIN. Finally, we corroborate that these guanosine effects are dependent on adenosine A1 and A2A receptors. Summarily, we demonstrate that guanosine modulates not only glutamate transporters but probably the activity of monocarboxylate transporters, allowing lactate transport in order to maintain ATP levels, viability, and cellular respiration in hippocampal slices of rats subjected to an in vitro cerebral ischemia protocol