Análises morfofisiológicas e bioquímicas com ênfase na peroxidação lipídica durante a interação do feijoeiro com Fusarim oxysporum

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2019.O processo de colonização do patógeno necrotróficos Fusarium oxysporum f sp. phaseoli (Fop), causador da murcha de Fusarium (MF) no feijoeiro, pode resultar na liberação de ácidos graxos. Durante a resposta de estresse, estes ácidos graxos tendem a ser peroxidados pela lipoxigenase ou espécies reativas de oxigênio dando origem a metabólitos envolvidos na defesa hospedeira. Assim, este trabalho teve como objetivo examinar a peroxidação lipídica em distintas fases de colonização de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, assim como determinar o envolvimento da lipoxigenase na resistência do feijoeiro. Para isso, plântulas de feijão dos genótipos UFSC-01 (resistente) e Uirapuru (suscetível) foram inoculados com uma suspensão conidial de Fop. A histologia da colonização do patógeno foi determinada aos 1, 3, 6 e 9 dias após a inoculação (dai). Também foram realizadas análises ultraestruturas aos 9 dai. Os ensaios bioquímicos referente à peroxidação lipídica (conteúdo de hidroperóxido de lipídios e malonaldeído), conteúdo de dienos e trienos conjugados, nível de H2O2 e atividade da ascorbato peroxidase (APX), catalase (CAT) e lipoxigenase (LOX) foram determinados espectrofotometricamente aos 0, 1, 3, 6 e 9 dai. A detecção da LOX por imunofluorescência foi determinada aos 3 e 9 dai. Foram amostradas as raízes e no hipocótilo para realizar todas as análises. Fop colonizou inter- e intracelular a epiderme e o córtex de ambos os genótipos e alcançou os vasos do xilema mais cedo em plantas suscetíveis. O acúmulo de compostos inter- e intracelulares no córtex e endoderme da raiz de plantas resistentes parece ter atrasado a colonização do patógeno. Abundantes hifas do patógeno foram encontradas próximos aos plasmodesmas de células xilemáticas da raiz de plantas suscetíveis. Em contrapartida, nestas regiões foi observado a formação de aposições elétron-densas da parede celular em plantas resistentes. Com relação à peroxidação lipídica, dois picos foram observados: o primeiro a 1 dai, caracterizado como uma resposta independente do genótipo; e outro aos 9 dai que foi específico de plantas suscetíveis e parece estar associado a destruição celular. O metabolismo oxidativo foi mais intenso em plantas resistentes, com um gradual aumento de H2O2 ao longo do tempo nas raízes, enquanto no hipocótilo a partir dos 3 dai, ou seja, antes do fungo alcançar este tecido. A atividade da LOX e o conteúdo dos conjugados foram maiores em plantas resistentes. Nas raízes, a indução da LOX ocorreu principalmente na endoderme, enquanto no hipocótilo epítopos da enzima foram localizados nos espaços inter- e intracelulares do xilema. Estes resultados demonstram que a lipoxigenase participa ativamente na resistência do feijoeiro a Fop.Abstract : The colonization process of necrotrophic pathogen Fusarium oxysporum f sp. phaseoli (Fop), causal agent of Fusarium wilt (MF) in common bean, can lead to the release of fatty acids. During stress response, these fatty acids can be peroxidized by lipoxygenase or reactive oxygen species originating metabolites involved in host' defense. Thus, the present work aimed to examine lipid peroxidation during the colonization of Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (Fop), as well as to determine the involvement of lipoxygenase in the resistance of common bean. For this, bean plants of UFSC-01 (resistant) and Uirapuru (susceptible) genotypes were inoculated with conidial suspension of Fop. Histology of pathogen colonization was determined at 1, 3, 6 and 9 days after inoculation (dai). Ultrastructural observations were realized at 9 dai. In biochemical assays, lipid peroxidation (content of lipid hydroperoxide and monoaldehyde), H2O2 and conjugated diene and triene, and activity of ascorbate peroxidase (APX), catalase (CAT) and lipoxigenase (LOX) were monitored spectrophotometrically at 0, 1, 3, 6 e 9 dai. LOX immunofluorescence was detected at 3 and 9 dai. Fop colonized inter- and intracellularly the epidermis and cortex in both genotypes, and reached xylem xylem vessels earlier in susceptible plants. Compounds accumulation in cortex and endoderm of resistant roots seems delay the pathogen progression. Abundant hyphae were observed near to plasmodesms in xylem cells of susceptible roots. In contrast, electron-dense cell wall appositions were observed in these areas of resistant roots. Regarding lipid peroxidation, two peaks were observed: the first one at 1 dai, characterized as a response independent of the genotype; and another one at 9 dai that was specific to susceptible plants and seems to be associated to cell destruction. Oxidative metabolism was more intense in inoculated resistant plants, where H2O2 levels gradually increased over time in roots, while from the 3 dai in hypocotyl, i.e., before Fop reached aerial tissue. Both LOX and its conjugate content were higher in resistant plants. In roots, LOX induction occurred manly near to endodermis, while in hypocotyl, enzyme epitopes were in inter- and intracellular spaces of xylem. These results demonstrate that lipoxygenase actively participates in bean resistance to Fop