Atividade da enzima de biotransformação uridina difosfato glicuronosiltransferase (UGT) em Chelonia mydas (Linnaeus, 1758)

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2020.Uma série de contaminantes químicos pode ser liberada no ambiente associada às atividades humanas. Alguns contaminantes podem causar efeitos tóxicos nos organismos expostos, como as tartarugas-verdes (Chelonia mydas). Essa exposição desencadeia respostas biológicas, que podem, potencialmente, servir como biomarcador. A enzima uridina difosfato glicuronosiltransferase (UGT) pertence à fase II do sistema de biotransformação de xenobióticos, e sua atividade pode ser explorada como biomarcador. Nesse contexto, este estudo teve como objetivo investigar a atividade da enzima UGT em amostras hepáticas microssomais de tartarugas-verdes. As amostras de tecido hepático foram provenientes de espécimes encontrados até seis horas após a morte nas praias da região da Bacia de Santos, desde Ubatuba, São Paulo, até Laguna, Santa Catarina. Também foram utilizadas amostras de fígado, intestino delgado e rim de dois espécimes de tartarugas-verdes que, após tratamento veterinário, precisaram ser eutanasiados. A atividade UGT foi quantificada pelo método adaptado de Collier e colaboradores (2000) e Ladd, Fitzsimmons e Nichols (2016), aplicando como substrato 4-metilumbeliferona (4-MU). Dentre os permeabilizadores testados, a atividade enzimática foi significativamente maior com alameticina e Brij ® 58, enquanto a aplicação de Triton ® X-100 gerou inibição e maior desvio padrão, de modo a ser excluído dos demais ensaios. A aplicação de sacarolactona (5 mM) e UDP-N-acetilglicosamina (1 mM) não foi justificada no ensaio na atividade UGT hepática de C. mydas, uma vez que provocou a inibição e a ausência de alterações significativas, respectivamente. A adição do magnésio (Mg 2+ ) e da albumina sérica bovina (BSA) aumentou a velocidade máxima (V max ) dos ensaios que continham alameticina e Brij ® 58 isoladamente. No entanto a contribuição desses reagentes foi significativa apenas no meio de reação com alameticina, e não com Brij ® 58. Duas hipóteses não mutuamente exclusivas foram propostas: 1) a possibilidade de sequestro de algum inibidor da UGT presente no meio de reação pelo surfactante; 2) a interação do Brij ® 58 com aminoácidos hidrofóbicos da UGT que pode ter levado à alteração conformacional que, por sua vez, facilitou a ligação do substrato ao sítio ativo da enzima. Assim, foi sugerido que enquanto a adição de BSA e Mg 2+ levam a um acréscimo de função no meio com alameticina, o mesmo não ocorre no meio com Brij ® 58. O maior valor de V max foi obtido na presença de alameticina (12,5 µg/mL), BSA (0,25 %) e Mg 2+ (1 mM), condição que, portanto, dentre as quatro padronizadas, possibilita a detecção de menores valores de atividade UGT. A atividade UGT detectada em microssoma hepático de C. mydas foi semelhante àquelas de outros estudos com aves e répteis que utilizaram substratos não-seletivos, como 4-MU, e a inibição gerada por diferentes compostos seguiu padrão semelhante ao descrito na literatura. Em conclusão, esta investigação permitiu detectar a atividade UGT em microssoma hepático, intestinal e renal de C. mydas pela primeira vez, e, desenvolveu ensaios enzimáticos que podem ser aplicados em programas de biomonitoramento ambiental e contribuir em ações de conservação dessa espécie ameaçada.Abstract: Several chemical contaminants can be released into the environment associated with human activities. Some contaminants can cause toxic effects on exposed organisms such as green turtles (Chelonia mydas). This exposure causes biological responses, which can potentially serve as a biomarker. The uridine diphosphate glucuronosyltransferases (UGT) enzyme belongs to phase II of the xenobiotic biotransformation system, and its activity can be explored as a biomarker. In this context, this study aimed to investigate the activity of the UGT enzyme in green turtle liver microsomal samples. Liver tissue samples were taken from specimens found within six hours after death, on the beaches of Bacia de Santos, from Ubatuba, São Paulo, to Laguna, Santa Catarina. Liver, small intestine and kidney samples were also obtained from two specimens of green turtles which, after veterinary treatment, had to be euthanized. The UGT activity was quantified by the adapted method of Collier et al. (2000) and Ladd, Fitzsimmons and Nichols (2016), applying 4-methylumbeliferone (4-MU) as substrate. Among the permeabilizers tested, the enzymatic activity was significantly higher with alamethicin and Brij ® 58, while the application of Triton ® X-100 generated inhibition and higher standard deviation, which is why it was excluded from the further assays. The application of saccharolactone (5 mM) and UDP-N-acetylglucosamine (1 mM) was not justified in the assay on C. mydas hepatic UGT activity as it caused inhibition and the absence of significant changes, respectively. The addition of magnesium (Mg 2+ ) and bovine serum albumin (BSA) increased the maximum velocity (V max ) of the enzymatic activity in the presence of alamethicin and Brij ® 58 separately. However, the contribution of these reagents was only significant in the reaction medium with alamethicin, and not with Brij ® 58. Two non-mutually exclusive hypotheses are proposed: 1) the possibility of kidnapping some UGT inhibitor present in the reaction medium by the surfactant; 2) the interaction of Brij ® 58 with UGT hydrophobic amino acids which may have led to conformational change which, in turn, facilitated the binding of the substrate to the active site of the enzyme. Thus, it is suggested that while the addition of BSA and Mg 2+ leads to increased function in the reaction medium with alamethicin, it does not occur in the medium with Brij ® 58. The highest V max value was obtained in the presence of alamethicin (12.5 µg / mL), BSA (0.25 %) and Mg 2+ (1 mM), a condition that, among the four standardized ones, allows the detection of lower values of UGT activity. The UGT activity detected in C. mydas liver microsome was similar to those of other studies with birds and reptiles that used non-selective substrates, such as 4-MU, and the inhibition generated by different compounds followed a similar pattern to that described in the literature. In conclusion, this research allowed the detection of UGT activity in C. mydas liver, intestinal and renal microsomes for the first time, and developed enzymatic assays that can be applied in environmental biomonitoring programs and contribute to conservation actions of this endangered species