Nanopartículas híbridas como sistema de entrega de siRNA : silenciamento in vivo do gene Vegf em câncer de mama

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2019A utilização de moléculas de siRNA para o silenciamento gênico tem adquirido importância para o tratamento do câncer, sendo que o primeiro fármaco baseado neste princípio foi aprovado nos EUA em 2018. A abordagem consiste em impedir a expressão de proteínas essenciais para o desenvolvimento da doença, dependendo do gene alvo. Neste trabalho, o gene Vegf foi selecionado, por ser um fator mediador da angiogênese no câncer e pode ser uma estratégia interessante para prevenir o crescimento e proliferação de células tumorais. Porém, há barreiras que precisam ser ultrapassadas para o siRNA alcançar as células alvo e promover o silenciamento gênico, após entrega sistêmica. As principais barreiras consistem na fragilidade da molécula de siRNA na circulação, no reconhecimento pelo sistema imune, na captação intracelular deficiente e no ambiente ácido do endossoma. Assim, o objetivo desse trabalho é verificar a eficiência de um nanocarreador em proteger e promover a entrega sistêmica de siRNA para o gene Vegf para terapia anti-câncer com alvo específico, em um modelo de câncer de mama murino. Nanopartículas híbridas contendo íons cálcio na fase inorgânica e copolímero em bloco PEG-ácido glutâmico na fase orgânica foram preparadas e purificadas utilizando sistema Amicon® Pro Purification. As nanopartículas formam-se por um processo próprio de organização (auto-associação) em condições estequiométricas. Para determinação do tamanho e morfologia, técnicas incluindo o Espalhamento Dinâmico de Luz (do Inglês Dynamic Light. Scattering, DLS) e Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) foram utilizadas. A fim de verificar a quantidade de íons cálcio e fósforo removidos durante o processo de purificação, ensaios colorimétricos foram realizados. Para os estudos in vivo, células de câncer de mama murino 4T1 foram inoculadas por via subcutânea na glândula mamária abdominal em camundongos Balb/c fêmeas. Para o ensaio antitumoral, nanopartículas carreando siVEGF foram injetadas na veia caudal e o tamanho do tumor e massa corporal foram monitorados por 14 dias. Após administração das nanopartículas foi realizada avaliação histopatológica dos órgãos e dos tumores, analisados os parâmetros hematológicos e bioquímicos e avaliado o silenciamento gênico por RT-qPCR e Western Blot. Para avaliar a biodistribuição e acúmulo no tumor, nanopartículas híbridas contendo siRNA marcado com cianina 5 foram injetadas pela via intravenosa utilizando a veia caudal. A intensidade de fluorescência no fígado, baço, pulmão, coração, rins e tumor foi determinada usando o equipamento In-Vivo Xtreme, normalizada pela massa. Os nanocarreadoes apresentaram tamanho e índice de polidispersão similares antes e após processo de purificação, com remoção eficiente de cálcio e fósforo livres. As imagens obtidas por MET revelaram que as nanopartículas purificadas apresentaram tamanho relativamente esférico e homogêneo. Foi observada a diminuição do tamanho dos tumores tratados com as nanopartículas contendo siVEGF. A redução no crescimento tumoral foi relacionada ao silenciamento in vivo do gene Vegf no grupo tratado. A intensidade de fluorescência em níveis significativos foi detectada nos rins e nos tumores tratados, indicando acúmulo de siRNA no tumor pela entrega efetiva dos nanocarreadores. Os resultados indicam os sistemas híbridos aqui desenvolvidos como carreadores efetivos de moléculas de siRNA para a terapia antitumoral, com o silenciamento do gene Vegf no câncer de mama.Abstract: The use of siRNA molecules for gene silencing has acquired importance for the cancer treatment, wherein the first drug based on this principle was approved in the US in 2018. The approach is to prevent the expression of proteins essential for the disease development, depending on the target gene. In this work, the Vegf gene was selected, since it is a mediating factor of angiogenesis in cancer and may be an interesting strategy to prevent the growth and proliferation of tumoral cells. However, is necessary to overcome barriers to systemically deliver siRNA to target cells and promote gene silencing. The main barriers are the fragility of siRNA in the circulation, recognition by the immune system, the inefficient cellular uptake, and the acid environment of the endosome. Thus, the aim of the present study is to verify the efficiency of a carrier system to protect and deliver siRNA to Vegf gene for a target-specific anti-cancer therapy in a murine breast cancer model. Hybrid nanoparticles composed of calcium ions as inorganic phase and a PEG-glutamic acid copolymer as the organic phase was prepared and purified using Amicon® Pro Purification System. The nanoparticles were formed by self-assembling of the components in stoichiometric conditions. For the determination of the size distribution and morphology of the nanocarriers, dynamic light scattering (DLS) technique and transmission electron microscopy (TEM) were carried out. To quantify the amount of calcium and phosphorus ions removed by the purification process, colorimetric assays were performed. For in vivo studies, female BALB/c mice were subcutaneously inoculated into the abdominal mammary gland with 4T1 breast carcinoma cells. For the antitumor activity, hybrid nanoparticles loading siVEGF were injected into the tail vein and tumor size and body weight were monitored for 14 days. After administration of the nanoparticles, histopathological evaluation of organs and tumors was performed, hematological and biochemical parameters were analyzed and gene silencing using RT-qPCR and Western Blot was evaluated. To evaluate biodistribution and tumor accumulation, hybrid nanoparticles containing Cy5-labeled siRNA were intravenously injected into the tail vein. The fluorescence intensity of the liver, spleen, lung, heart, kidneys, and tumor was determined using the In-Vivo Xtreme system and normalized to the weight. Nanocarriers were confirmed to have similar size and polydispersity index before and after the purification process with efficient removal of free calcium and phosphorus. The TEM images revealed nanoparticles with a relatively homogenous rounded shape. The decrease in the size of the tumors treated with the nanoparticles containing siVEGF was observed. The reduction in tumor growth was related to in vivo Vegf gene silencing in the treated group. Significantly fluorescence intensity was detected in kidney and tumors treated, indicating enhanced tumor accumulation of siRNA by hybrid nanoparticles delivery. The results indicate the hybrid systems developed here as effective carriers of siRNA molecules for anticancer therapy with the Vegf gene silencing in breast cancer