Caracterização de levedura Saccharomyces cerevisiae recombinante mutada no gene STB5

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2018.Atualmente, o Brasil é o segundo maior produtor de etanol do mundo. O etanol é um biocombustível renovável que pode reduzir nossa dependência da gasolina, de origem fóssil. A produção no Brasil ocorre através da fermentação do caldo e melaço da cana-de-açúcar (Saccharum oficinarum) mediado pela levedura Saccharomyces cerevisae. Entretanto, a biomassa lignocelulósica oriunda da cana usada na produção do etanol é pouco aproveitada. Na biomassa lignocelulósica, encontra-se a xilose, segundo açúcar mais abundante na natureza. A conversão deste açúcar a etanol pela S. cerevisiae é de grande interesse para a indústria. Para isso, modificações genéticas já foram estabelecidas para sua utilização pela S. cerevisiae. Apesar disso, o processo como um todo necessita de melhorias, e a internalização da xilose é um passo limitante. Sabe-se que, em S. cerevisiae, a xilose é internalizada por transportadores da família Hxt através de um processo de difusão facilitada. Nosso grupo de pesquisa realizou um experimento de engenharia evolutiva utilizando uma levedura com todos genes que codificam para os transportadores Hxt deletados (hxt-null), com exceção do gene HXT2, sobreexpresso pelo promotor de expressão constitutiva PGK. Após a engenharia evolutiva, a levedura apresentou melhoria no consumo da xilose e, através de sequenciamento, foi descoberta uma mutação no gene STB5. Este gene é um fator de transcrição tipo dedo de zinco envolvido na regulação da via das pentose-fosfato e produção de NADPH pela levedura. Assim, no presente trabalho, buscou-se caracterizar os efeitos desta mutação através da deleção do gene STB5 das linhagens evoluídas, e posterior inserção na levedura parental através de vetor, a fim de avaliar o fenótipo adquirido. Nossos resultados demonstram que mesmo após a deleção do gene, ensiaos de verificação demonstraram a persistência do gene no genoma da levedura. Uma análise por citometria de fluxo revelou um genoma diploide nas leveduras parental e evoluída, provavelmente por um processo de autodiploidização. No entanto, mesmo após a deleção da segunda cópia do gene, o mesmo ainda estava presente no genoma da levedura. Uma análise de expressão relativa por qPCR demonstrou que o STB5 continuava sendo expresso, mesmo após a deleção de duas cópias do gene. Portanto, a levedura evoluída apresentou mais do que duas cópias do gene STB5 em seu genoma, impedindo a deleção completa deste gene, e a análise da possível correlação entre o gene mutado e o fenótipo adquirido.Abstract: Currently, Brazil occupies the second position on worldwide ethanol production. Ethanol is a renewable biofuel that can reduce our dependence on gasoline, a fossil fuel. The Brazilian production occurs through fermentation of sugarcane broth and molasses, mediated by Saccharomyces cerevisiae. However, lignocelullosic biomass, derived from sugarcane is yet underutilized by the industry. Xylose, the second most abundant sugar on nature, is part of the hemicelullosic portion of that biomass. The S. cerevisiae conversion of xylose to ethanol is of great interest for the biofuels industry, and genetic modifications have been developed for its consumption by this yeast. However, the process requires improvements, and pentose internalization is a limiting-step. It?s well known that xylose enters the yeast cell through the Hxt family of transporters by facilitated diffusion. Our research group performed an evolutionary engineering experiment with an hxt-null yeast containing a plasmid vector overexpressing the gene HXT2 through the constitutive PGK promoter. After the evolutionary engineering, the yeast strain showed better xylose consumption, and further sequencing of its genome showed an mutation on the zincfinger transcription factor encoded by the STB5 gene, that regulates the pentose phostate pathway and NADPH production by yeasts. In the present work, we aimed to characterize the effect of this mutation through the deletion of the STB5 gene from the evolved yeast, and its insertion in the parental yeast with a vector, aiming to evaluate the acquired phenotype. Our results showed that even after deletion of STB5 from de evolved yeast, the gene was still present in the genome. A flow cytometer analysis showed that both the parental and evolved yeasts had a diploid genome, probably a consequence of autodiploidization. However, after deletion of the second copy of the STB5 gene, this gene was still present in the genome of the yeast. A qPCR analysis showed that the relative expression of the STB5 gene was the same, even after the deletion of the two copies of the gene. Thus, the evolved yeast has more than two copies of the STB5 gene in its genome, not allowing its proper deletion, and the analysis between the mutation and the acquired phenotype