Desenvolvimento de um ensaio imunoenzimático para detecção de anticorpos IgG anti-proteína de nucleocapsídeo do vírus SARS-CoV-2

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2022.Introdução: O vírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave 2 (SARS-CoV-2) causador da Coronavírus Disease (COVID-19) é responsável pela maior pandemia do século XXI até o presente momento, onde já causou a morte de mais de 6.2 milhões de pessoas no mundo todo, sendo próximo das 664 mil mortes apenas no Brasil. Os instrumentos de vigilância são essenciais para avaliar a imunidade adquirida, seja por infecção natural da doença ou por vacinação, e desta maneira servir para tomadas de decisões para a gestão da pandemia. O SARS-CoV-2 é um sarbecovírus pertencente à família Coronaviridae. Seu genoma é um RNA simples fita sentido positivo, o qual é responsável por codificar proteínas estruturais e não-estruturais. Dentre as proteínas estruturais se destacam duas proteínas altamente imunogênicas: a proteína de pico Spike (S), que é responsável por se ligar na enzima conversora de angiotensina 2 (ECA2) presente na membrana das células hospedeiras, permitindo assim a entrada do vírus na célula, e a proteína de nucleocapsídeo (N),responsável pela proteção do material genético viral. A proteína N pode ser um importante alvo para epidemiovigilância, pois tem as características de ser imunogênica e conservada, desta maneira, com o surgimento de novas variantes, uma resposta contra essa proteína ainda poderia ser identificada por técnicas tradicionais. Neste projeto desenvolvemos um teste de ELISA indireto para detecção de anticorpos IgG em pacientes convalescentes de COVID-19. utilizando uma proteína de nucleocapsídeo recombinante N(50-350). Metodologia: Como antígeno de captura para o desenvolvimento do ELISA, foi utilizado uma proteína de nucleocapsídeo recombinante N(50-350) expressa em E. coli Bl-21 e purificada in house pelo por coluna de afinidade. Soros de pacientes convalescentes de COVID-19, foram utilizados para padronização do ELISA. Foram testadas variações das soluções de bloqueio, diluição do anticorpo secundário, concentração do antígeno, o tempo de reação da enzima-substrato e os tempos de incubação da solução de bloqueio e dos soros. Resultados: A N(50-350) foi expressa em corpos de inclusão em bactérias BL21-CodonPlus e purificada por colunas de níquel. O ELISA foi padronizado com 3 ug/mL de antígeno, bloqueio com leite 5% por 2h, incubação dos soros por 24h e reação substrato/enzima por 7 min. O ELISA apresentou uma sensibilidade e especificidade de 98,8% e 93,6% para detecção de 10 IgG anti-proteína N do SARS-CoV-2. Conclusão: O ELISA desenvolvido demonstrou ser um ensaio específico e sensível para detecção de IgG de pacientes convalescentes. Desta maneira, pode ser usado como uma ferramenta de epidemiovigilância e de ensaios de imunogenicidade em testes de vacinas.Abstract: Introduction: The Severe Acute Respiratory Syndrome 2 virus (SARS-CoV-2) that causes the Coronavirus Disease (COVID-19) is responsible for the biggest pandemic of the 21st century to date, where it has already caused the death of more than 6.2 million people. people worldwide, being close to the 664 thousand deaths in Brazil alone. Surveillance instruments are essential to assess acquired immunity, either by natural infection of the disease or by vaccination, and thus serve to make decisions for the management of the pandemic. SARS-CoV-2 is a sarbecovirus belonging to the Coronaviridae family. Its genome is a positive-sense single-stranded RNA, which is responsible for encoding structural and non-structural proteins. Among the structural proteins, two highly immunogenic proteins stand out: the spike spike protein (S), which is responsible for binding to the angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) present in the membrane of host cells, thus allowing the entry of the virus into the cell. , and the nucleocapsid protein (N), responsible for protecting the viral genetic material. The N protein can be an important target for epidemiosurveillance, as it has the characteristics of being immunogenic and conserved, in this way, with the emergence of new variants, a response against this protein could still be identified by traditional techniques. In this project we developed an indirect ELISA test for detection of IgG antibodies in COVID-19 convalescent patients. using a recombinant N(50-350) nucleocapsid protein. Methodology: As capture antigen for the development of the ELISA, a recombinant nucleocapsid protein N(50-350) expressed in E. coli Bl-21 and purified in house by affinity column was used. Sera from convalescent COVID-19 patients were used to standardize the ELISA. Variations of blocking solutions, secondary antibody dilution, antigen concentration, enzyme-substrate reaction time and incubation times of blocking solution and sera were tested. Results: N(50-350) was expressed in inclusion bodies in BL21-CodonPlus bacteria and purified by nickel columns. The ELISA was standardized with 3 ug/mL of antigen, blocking with 5% milk for 2h, incubation of the sera for 24h and substrate/enzyme reaction for 7 min. The ELISA had a sensitivity and specificity of 98.8% and 93.6% for detection of IgG anti-SARS-CoV-2 N protein. Conclusion: The ELISA developed proved to be a specific and sensitive assay for 12 detecting IgG in convalescent patients. In this way, it can be used as an epidemio-surveillance and immunogenicity assay tool in vaccine trials