Alterações bioquímicas e moleculares em peixes Poecilia vivipara (Bloch e Schneider, 1801) expostos ao esgoto sanitário e 4-n-Nonilfenol

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2019.Nas últimas décadas, diversas substâncias químicas naturais ou de origem antrópicas potencialmente tóxicas têm sido lançadas no ambiente promovendo a contaminação dos ecossistemas. A poluição ambiental atualmente constitui um dos maiores problemas de saúde pública enfrentados em escala global. Ambientes aquáticos estão sujeitos a ameaças de múltiplas atividades humanas convertendo-se em uma espécie de sumidouro de contaminantes. A preocupação com a qualidade da água é prioritária, visto que até 2050 a população mundial deve ultrapassar nove bilhões de habitantes. O lançamento de esgoto sanitário não tratado é considerado a principal fonte de contaminantes de ambientes costeiros podendo apresentar uma numerosa família de compostos naturais ou sintéticos, referida como ?contaminantes emergentes?. Dentre os compostos químicos presentes no esgoto há uma classe de surfactantes não iônicos altamente tóxicos: os alquilfenóis etoxilados (APEOs). Os APEOs são amplamente utilizados na produção de diversos produtos químicos. Há uma crescente preocupação quanto aos APEOs no ambiente devido ao fato de seus metabólitos serem menos biodegradáveis, mais lipofílicos e tóxicos que seus precursores e mimetizarem hormônios. O 4-n-Nonilfenol (NP) é apontado como o metabólito mais crítico dos APEOs. Monitorar os tipos e quantidades de substâncias tóxicas no ambiente, principalmente em misturas complexas, é uma tarefa exaustiva e desafiadora. Ferramentas integrativas baseadas em efeito, como biomarcadores, são recomendadas para o monitoramento da qualidade ambiental. Neste estudo, peixes Poecilia vivipara foram expostos ao esgoto sanitário na diluição de 33 % (v/v) por 24 e 96 horas para avaliar a resposta molecular de exposição através da identificação de transcritos gênicos no fígado dos animais expostos. Para isto foi realizada a montagem de novo do transcriptoma hepático utilizando as plataformas Ion Proton e MiSeq. Foram montadas 120.277 sequências via Ion Proton e 54.285 via Illumina MiSeq. A exposição ao esgoto sanitário alterou os níveis transcricionais hepáticos dos peixes, principalmente após 96 h de exposição, no qual foram observados 14 efeitos de interação nos genes receptores: Receptor para aril hidrocarboneto (AhR), Receptor pregnano x (PXR); genes de biotransformação de fase I: Citocromo P450 família 1A1 (CYP1A1), Citocromo P450 família 2K1 (CYP2K1), Citocromo P450 família 3A30 (CYP3A30), NADPH-quinona oxidorredutase-1 (NQO1); genes de biotransformação de fase II: Uridina difosfato glicuronosiltransferase 1A1 (UGT1A1), Glutationa S-transferase A3 (GSTa3), Glutationa S-transferase Mu 3 (GSTmu), Sulfotransferase 1C1 (ST1C1); enzimas anitioxidantes: Superóxido dismutase (SOD); transportadores do tipo ABC: Proteína associada a multirresistência 1 (ABCC1), Resistência a múltiplas drogas (MDR1) e relacionado a desregulação endócrina: Fator de transcrição SOX9 (SOX9), analisados por qPCR. Além de respostas transcricionais, foram observadas alterações nas atividades enzimáticas hepáticas e branquiais: superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase total (GPx) e dependente de selênio (Se-GPx), glutationa redutase (GR), glutationa-S-transferase (GST), glicose-6-fosfato desidrogrenase (G6PDH) e etóxi-resorufina O-deetilase (EROD). Todas as enzimas estudadas no presente trabalho apresentaram alguma diferença em ambos os períodos de exposição no fígado, e nas brânquias houve uma prevalência de resultados significativos após 96 h. Entretanto, a maioria das diferenças observadas foram em relação ao sexo dos animais e não à exposição ao esgoto. Os níveis transcricionais dos mesmos genes analisados no primeiro estudo foram quantificados em fígado de peixes P. vivipara injetados intraperitonealmente com NP (15 µg/g e 150 µg/g). Quatro apresentaram diferenças significativas em fígados de fêmeas: AhR, PXR, GSTa3, e SOX9, todos induzidos na dose menor de 15 µg/g de NP. Em machos, três foram alterados significativamente na dose menor, sendo um gene induzido: ABCC1, e dois reprimidos: GSTa3 e MRP2. Na dose maior, de 150 µg/g de NP, GSTa3 foi reprimido em fígado de machos. Quanto às gônadas, foram observadas alterações significativas em ABCC1 e SOX9 de fêmeas expostas à maior dose de NP. Os resultados desse estudo demonstram que o esgoto sanitário e o NP afetaram diretamente o organismo dos peixes apresentando alterações em vias metabólicas como a de receptores nucleares, enzimas antioxidantes, biotransformação de fase I e II, transportadores do tipo ABC e relacionadas a desregulação endócrina, todas identificadas nos transcriptomas hepáticos aqui produzidos. As informações geradas nesse trabalho indicam que P. vivipara é um promissor modelo de organismo sentinela para estudos de ecotoxicologia, além disso, o grande avanço na obtenção de informações nucleotídicas para a espécie corrobora para a sua manutenção como organismo modelo. Também foram apresentados os primeiros estudos de exposição da espécie a xenobióticos levando em consideração fatores como sexo. Este conhecimento quanto ao modo de resposta de biomarcadores em relação ao gênero é fundamental para evitar interpretações equivocadas na avaliação de biomarcadores quanto aos efeitos dos poluentes.Abstract: In recent decades, several potentially toxic natural or anthropogenic chemicals have been released into the environment promoting contamination of ecosystems. Environmental pollution is currently one of the biggest problems facing the world, representing a global public health problem. Aquatic environments are subject to threats from multiple human activities, becoming a kind of contaminant sink. Concern about water quality becomes a priority, given that by 2050 over nine billion inhabitants will be exceeded. The release of untreated sanitary sewage is considered the main source of contaminants from coastal environments, presenting a large family of natural or synthetic compounds, referred to as ?emerging contaminants?. Among the chemical compounds present in sewage is a class of highly toxic nonionic surfactants: ethoxylated alkylphenols (APEOs). APEOs are widely used in the production of various chemicals. There is growing concern about APEOs in the environment because their metabolites are less biodegradable, more lipophilic and toxic than their precursors and mimic hormones. 4-n-Nonylphenol (NP) is identified as the most critical metabolite of APEOs. Monitoring the types and quantities of toxic substances in the environment, especially in complex mixtures, is an exhausting and challenging task. Integrative effect-based tools such as biomarkers are recommended for environmental quality monitoring. In this study, Poecilia vivipara fish were exposed to raw untreated sewage 33% (v/v) for 24 and 96 hours for identification of molecular biomarkers by a de novo transcriptome assembly of liver via next generation sequencers Ion Proton and MiSeq. 120,277 sequences were assembled via Ion Proton and 54,285 via Illumina MiSeq. Sanitary sewage was able to alter liver transcriptional levels of fish, especially after 96 h of exposure, in which 14 interaction effects were observed on the receptor genes: Aryl hydrocarbon receptor (AhR), Pregnane X receptor (PXR); phase I biotransformation genes: Cytochrome P450 family 1A (CYP1A), Cytochrome P450 family 2K1 (CYP2K1), Cytochrome P450 family 3A30 (CYP3A30), NAD(P)H dehydrogenase [quinone]1 (NQO1); phase II biotransformation genes: UDP glycosyltransferase 1A1 (UGT1A1), Glutathione S-transferase A3 (GSTa3), Glutathione S-transferase Mu 3 (GSTmu), Sulfotransferase 1C1 (ST1C1); antioxidant enzymes: Superoxide dismutase (SOD); ABC transporter genes: ATP Binding Cassette Subfamily C Member 1 (ABCC1), Multidrug resistence protein 1 (MDR-1), and related to endocrine disruption: SRY-Box9 (SOX9), measured by qPCR. In addition to transcriptional responses, changes in gills and liver enzymatic activities such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), total and selenium-dependent glutathione peroxidase (GPx and Se-GPx), glutathione reductase (GR), glutathione-S-transferase (GST), glucose-6-phosphate dehydrogrenase (G6PDH) and ethoxy resorufin O-deethylase (EROD) were observed. All enzymes studied in the present study in liver showed some difference in both exposure times, while in the gills there was a prevalence of significant results after 96 h. However, most of the differences observed were regarding animal gender and not sewage exposure. The transcriptional levels of the same genes from the sewage experiment were evaluated by qPCR in liver of P. vivipara injected intraperitoneal with NP (15 µg/g and 150 µg/g). Four genes showed significant differences in female livers: AhR, PXR, GSTa3, and SOX9, all induced at the lower dose of 15 µg/g NP. In males, only three were significantly altered at the lowest dose, one induced gene: ABCC1, and two suppressed genes: GSTa3 and MRP2. At the highest dose of 150 µg/g NP, only GSTa3 was repressed in male liver. Regarding the gonads, significant changes were observed only in ABCC1 and SOX9 of females exposed to the highest dose of NP. The results of this study demonstrate that sanitary sewage and NP directly affected the fish organism presenting alterations in several metabolic pathways identified in the hepatic transcriptome produced here. Alterations in liver transcription and enzymatic activities in P. vivipara fish demonstrated the importance of the liver metabolic role in maintaining homeostasis against xenobiotic insults. The information generated in this work is a great advance in the maintenance of the species as a promising model of sentinel organism in ecotoxicology studies, and in the nucleotide information for the species. The first studies of P. vivipara exposure to xenobiotics considering factors such as gender was also presented. This knowledge about how biomarkers respond to gender is critical to avoid misinterpretation in biomarker evaluation