Avaliação dos efeitos do nucleosídeo guanosina e da ativação farmacológica de canais de potássio (BK) em um modelo de isquemia cerebral in vitro

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2019.O Acidente Vascular Encefálico (AVE) representa a segunda maior causa de morte e a principal causa de incapacidade em adultos mundialmente. O AVE isquêmico é caracterizado pela oclusão de um vaso sanguíneo cerebral e é responsável por cerca de 80% dos casos de AVE. A ausência do suprimento de glicose e oxigênio no tecido afetado desencadeia o déficit da produção energética, o desbalanço eletroquímico, o estresse oxidativo e a toxicidade glutamatérgica, levando à morte celular. Considerando as limitações existentes nos tratamentos disponíveis na clínica para o AVE, bem como o importante papel exercido pela excitotoxicidade glutamatérgica nesta patologia, torna-se imprescindível o estudo de compostos capazes de modular a transmissão glutamatérgica e conferir neuroproteção frente ao dano isquêmico. Sendo assim, o nosso grupo de pesquisa vem estudando a guanosina (GUO), um nucleosídeo derivado da guanina com diversos efeitos neuroprotetores descritos, como efeitos tipo anti-depressivo, anti-nociceptivo, indução da proliferação celular e a liberação de fatores neurotróficos. Em modelos de isquemia cerebral in vivo e in vitro a GUO já demonstrou diversos efeitos neuroprotetores, atuando sobre a captação e liberação de glutamato, reduzindo a produção de espécies reativas e promovendo a manutenção da viabilidade celular. Apesar de não possuir o seu mecanismo de ação completamente elucidado, trabalhos prévios do nosso grupo de pesquisa sugerem a interação da GUO com a ativação dos canais de potássio dependentes de Ca2+ de alta voltagem (canais BK). Os canais BK são ativados por Ca2+ intracelular e pela variação de voltagem da membrana celular, exercendo um importante papel em diversos processos fisiológicos como na liberação de neurotransmissores e na excitabilidade neuronal. A sua modulação demonstrou efeito neuroprotetor frente a modelos de isquemia in vitro e in vivo. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi investigar a ativação dos canais BK, através do ativador NS1619, no efeito neuroprotetor da GUO em fatias hipocampais e em culturas primárias de astrócitos corticais submetidos à privação de glicose e oxigênio (PGO), um modelo de isquemia cerebral in vitro. Os resultados obtidos demonstraram que a PGO diminui significativamente a viabilidade celular e o potencial de membrana mitocondrial das fatias hipocampais, e o tratamento com o ativador NS1619 parcialmente previne o dano mitocondrial. A indução da PGO nos astrócitos corticais promoveu o aumento do dano celular e a redução da captação de glutamato, a qual é parcialmente prevenida por GUO e NS1619. Observou-se um aumento nos níveis extracelulares de lactato ao longo do período de 24 horas de reoxigenação em todos os tratamentos. No entanto, somente PGO+GUO foi estatisticamente diferente de PGO em 24 horas. De forma geral, os nossos resultados sugerem que o ativador NS1619 possa estar atuando sobre os canais BK mitocondriais, porém, somente a ativação dos canais BK não promove neuroproteção frente ao dano isquêmico similar ao observado pela GUO em trabalhos prévios do grupo. Apesar de trabalhos anteriores terem demonstrado que o bloqueio dos canais BK interfere no efeito neuroprotetor da GUO, os nossos resultados sugerem a possibilidade da ocorrência de um efeito antagônico no co-tratamento com a GUO e com o ativador NS1619. Estudos adicionais são necessários para investigar a participação do canal BK no efeito protetor da guanosina.Abstract : Stroke represents the second leading cause of death and the main cause of disability in adults worldwide. Ischemic stroke is characterized by brain blood vessel occlusion and is responsible for about 80% of the total stroke cases. The absence of oxygen and glucose supply to the affected tissue triggers a failure on energetic production, electrochemical unbalance, oxidative stress and glutamatergic toxicity, leading to cell death. Considering the limitations on available stroke clinical treatments, as well as the important role of glutamatergic excitotoxicity in this pathology, the study of compounds that modulate glutamatergic transmission and afford neuroprotection against ischemic insult is desirable. Our research group has been studying the guanosine (GUO), a guanine derivative nucleoside with many neuroprotective effects described, as antidepressant-like and anti-nociceptive effects, cell proliferation induction and neurotrophic factors release. In in vivo and in vitro models of brain ischemia GUO showed neuroprotective effects, acting on the glutamate uptake and release, modulating the reactive species generation, and the cellular viability. Although its mechanism of action it is not completely elucidated, previous studies of our research group suggest the GUO interaction with a large conductance Ca2+-dependent K+ channel (BK channels) activation. BK channels are activated by intracellular Ca2+ and voltage variation, exerting an important role in neurotransmitters release and neuronal excitability. BK activation is neuroprotective against in vitro and in vivo ischemia models. The aim of this study was to investigate BK channels activation, through its activator NS1619, on the neuroprotective effect of GUO in hippocampal slices and primary cell culture of cortical astrocytes subjected to oxygen and glucose deprivation (OGD), an in vitro model of brain ischemia. OGD significantly decreases cellular viability and mitochondrial membrane potential of hippocampal slices, and the NS1619 (BK activator) treatment partially prevents the mitochondrial damage. In cortical astrocytes subjected to OGD it was observed an increase of cellular damage and a decrease on glutamate uptake. There is an increase on extracellular lactate levels during the 24 hours of reoxygenation evoked by GUO, NS1619, or both treatments. However, only OGD+GUO group presented statistical significance from OGD group at 24 hours. In summary, our results suggest that NS1619 may be acting via mitochondrial BK channels, however, only BK channels activation does not provide neuroprotection against ischemic insult similar to GUO effects previously demonstrated. Besides the fact that previous studies have shown that blockade of BK channels abolishes GUO neuroprotective effect, our results suggest the possibility of an antagonistic effect of GUO and NS1619. Additional studies are necessary in order to unravel the role of BK channels activation on the neuroprotective effect of guanosine