Biosurfactant production by Bacillus subtilis ATCC 6051 using brewery waste as a carbon source

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2019.No cenário atual, a busca por tecnologias limpas foi intensificada devido ao aumento da conscientização ambiental e à criação de legislações ambientais mais rigorosas, buscando viabilizar a substituição dos processos industriais tradicionais por processos biológicos. A síntese de biomoléculas tem sido foco de muitos estudos na literatura, nos quais os biossurfactantes têm se destacado devido às suas vantagens frente aos surfactantes obtidos por processos químicos. Essas vantagens são: alta biodegradabilidade, baixa toxicidade, redução da tensão superficial e a possibilidade de serem produzidos por fontes renováveis. Atualmente, a produção de biossurfactantes apresenta projeções de valorização de mercado nos próximos anos. No entanto, os altos custos de produção e purificação dificultam a produção em escala industrial, sendo o substrato um dos fatores que mais encarece o processo. Nesse contexto, este trabalho teve como objetivo a produção de biossurfactante por Bacillus subtilis ATCC 6051 em meio submerso, utilizando resíduo de cervejaria (Trub) como fonte alternativa de carbono. O trabalho consistiu em estudar os efeitos dos parâmetros de processo na produção de biossurfactante. Para tanto, foi utilizado um Planejamento Fatorial Completo (FFD), no qual os fatores Trub (% v/v), extrato de levedura (g L-1) e agitação (rpm) apresentaram efeito estatisticamente significativo na tensão superficial (ST) para o primeiro planejamento (24). A concentração máxima de surfactina obtida foi de 62,74 mg L-1. Com o segundo planejamento experimental refinado (22), foi possível obter um modelo de regressão quadrática adequado para descrever a variável resposta. Também foi avaliado o efeito da adição de metais (ferro, potássio, magnésio e manganês) no meio de cultura definido na primeira etapa, no qual o estudo indicou que todas as soluções metálicas adicionadas ao mesmo tempo exerceram influência sobre a ST. Além disso, o efeito sinérgico das soluções combinadas no meio de cultura promoveu a produção de surfactina, uma vez que a concentração máxima de surfactina obtida foi de 210,11 mg L-1, após 28 h de cultivo, enquanto no ensaio sem metais foi de 121,20 mg L-1 após 40 h. A produção de surfactina também foi avaliada em biorreator de tanque agitado acoplado a um coletor de espuma, no qual a agitação (vvm) e a aeração (rpm) foram estudadas por um FFD (22). Somente a agitação mostrou efeito significativo na concentração de surfactina e o modelo mostrou um valor do coeficiente de regressão (R2) de 0,99915. A concentração máxima de surfactina alcançada foi de 239,734 mg L-1, comprovando que o biossurfactante foi produzido com sucesso em maior escala. A atividade antimicrobiana da surfactina contra P. aeruginosa DSM 3227, E. coli ATCC 25922, S. aureus DSM 20231 e S. epidermidis DSM 28319 foi avaliada pela técnica de microdiluição em placa de 96 poços. A atividade antimicrobiana foi observada contra todas as cepas, atingindo a maior inibição (100%) para P. aeruginosa (500 µg mL-1 de tratamento). Uma redução logarítmica de 3,91 foi alcançada para P. aeruginosa e, para S. aureus e S. epidermidis, foram exibidas de 1 a 2 reduções logarítmicas após o tratamento. Nos ensaios antibiofilme contra P. aeruginosa, a maior inibição para co-incubação, anti-adesivo e ruptura foi de 79,80 (400 µg mL-1), 58,81 (350 µg mL-1) e 44,94 (700 µg mL-1), respectivamente. Este estudo fornece evidências de que a surfactina produzida a partir de um substrato de baixo custo pode ser um biocida promissor devido às suas habilidades antimicrobiana, antiadesiva e antibiofilme contra patógenos.Abstract: In the current scenario, the search for clean technologies has been intensified due to the increase of environmental awareness and the creation of stricter environmental legislation, seeking to enable the replacement of traditional industrial processes for biological processes. The synthesis of biomolecules has been the focus of many studies in the literature, in which biosurfactants have been outstanding due to their advantages over surfactants obtained by chemical processes. These advantages are high biodegradability, low toxicity, surface tension reduction, and the possibility of being produced by renewable sources. Currently, the production of biosurfactants is active and with projections of market appreciation in the coming years. However high production and purification costs have made production at industrial scale difficult and the substrate is one of the most expensive factor. In this context, this work aimed at the production of biosurfactant by Bacillus subtilis ATCC 6051 in submerged medium using brewery residue (Trub) as an alternative carbon source. The work consisted of studying the effects of process parameters on biosurfactant production. For this purpose, a Full Factorial Design (FFD) was used, in which the factors Trub (% v/v), yeast extract (g L-1), and agitation (rpm) presented a statistically significant effect on surface tension (ST) for the first design (24). The maximum surfactin concentration obtained was 62.74 mg.L-1. With the second refined experimental design (22), it was possible to obtain a suitable quadratic regression model to describe the response variable. The effect of the addition of metals in the culture medium defined in the first stage was evaluated (Iron, Potassium, Magnesium and Manganese). The study indicated that all added metal solutions at the same time, exerted influence on ST. In addition, the synergistic effect of the combined solutions on the culture medium promoted the production of surfactin, since the maximum surfactin concentration obtained was 210.11 mg L-1, after 28 h of cultivation, while for the non-metal assay, it was 121.20 mg L-1 after 40 h. The surfactin production was also evaluated in stirred tank bioreactor coupled with a foam collector, in which agitation (vvm) and aeration (rpm) was studied by a FFD (22). Only agitation showed a significant effect on surfactin concentration and the model showed a regression coefficient (R2) value of 0.99915. The maximum surfactin concentration reached was 239.74 mg L-1, proving that biosurfactant was successfully produced on a larger scale. The antimicrobial activity of surfactin against P. aeruginosa DSM 3227, E. coli ATCC 25922, S. aureus DSM 20231 and S. epidermidis DSM 28319 was evaluated by microdilution technique in 96-well plate. The antimicrobial activity was observed against all the strains, achieving the highest inhibition (100%) for P. aeruginosa, at 500 µg mL-1. A log reduction of 3.91 was achieved for P. aeruginosa and, to S. aureus and S. epidermidis were exhibited from 1 to 2 log reductions after treatment. In the antibiofilm assays against P. aeruginosa, the highest inhibition for co-incubation, anti-adhesive and disruption was 79.80 (400 µg mL-1), 58.81 (350 µg mL-1) and 44.94 (700 µg mL-1), respectively. This study provides evidence that surfactin produced from a low-cost substrate can be a promising biocide due to its antimicrobial, anti-adhesive and antibiofilm abilities against pathogens