Dinâmica da grk2 no rim: um possível mecanismo para a insuficiência renal aguda na sepse

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2021.Sepse é definida como uma disfunção orgânica com risco de vida, causada por uma resposta imune exacerbada frente à infecção. Os achados clínicos da sepse incluem vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular e diminuição da reatividade aos vasoconstritores, levando a hipotensão refratária, sendo o óxido nítrico (NO) um importante modulador neste quadro. Em oposição a circulação sistêmica, a reatividade vascular renal é preservada na sepse, contribuindo para a insuficiênia renal aguda (IRA) na sepse. Dados prévios de nosso laboratório mostram que o NO (derivado da NOS-2) ativa a cinase de receptor acoplado à proteína G (GRK2) na aorta e no coração, levando à diminuição da densidade dos receptores adrenérgicos a1 e ß1 que, por sua vez, está associada à diminuição da reatividade vascular e cardíaca na sepse, respectivamente. Dessa forma, nosso objetivo foi investigar se a IRA, na sepse, ocorre por ativação da via NO-GRK2-receptor a1 adrenérgico. Camundongos fêmeas selvagens Swiss e C57BL/6 NOS-2-KO foram submetidos à sepse por ligadura e perfuração do ceco (CLP). Camundongos Swiss foram tratados com um inibidor de NOS-2 (1400W; 1 mg/kg), com inibidor da guanilato ciclase solúvel (azul de metileno; s.c.; 10mg/Kg) 6, 12 e 18 h após CLP 30 min antes e 6 e 12 horas após CLP ou com um antagonista do receptor adrenérgico a1 (prazosina; 1 mg/Kg), 12 horas após CLP. Experimentos in vivo, moleculares e bioquímicos foram realizados 24 h após CLP.Camundongos Swiss não sépticos foram tratados com um doador de NO (SNAP, 10 mg / Kg) e as análises foram realizadas após 4 h. Ensaios complementares foram feitos em células epiteliais de rim de porco (LLC-PK1), tratadas com SNAP (100 µM) e na presença ou não de um inibidor de guanilato ciclase solúvel (ODQ, 1 µM) ou do inibidor de proteassoma (MG132; 10 µM) e as análises foram realizadas após 4 h. Nossos resultados mostram que a sepse diminuiu a pressão arterial média, a reatividade vascular à fenilefrina e o fluxo sanguíneo renal basal, o qual foi normalizado pelo tratamento com prazosina. A sepse levou a um aumento na expressão de NOS-2 renal, na produção de NO, nos metabólitos do NO e nos níveis plasmáticos de creatinina e ureia. Os níveis de GRK2 e ß-arrestina diminuiram e a densidade do receptor a1 adrenérgico aumentou no rim durante a sepse. A diminuição de GRK2 renal foi prevenida em camundongos NOS-2-KO ou camundongos tratados com 1400W, mas não pelo tratamento com azul de metileno. A densidade do receptor da angiotensina II (AT1) não foi alterada no rim séptico. Já a densidade do receptor ß1 adrenérgico aumentou no coração séptico e os níveis de ß-arrestina reduziram. O tratamento com um doador de NO reduziu o conteúdo de GRK2 no rim de camundongos não sépticos e em células LLC-PK1. A diminuição do nível de GRK2 em células LLC-PK1 foi prevenida pela inibição da guanilato ciclase solúvel, mas não com o inibidor de proteassoma. Portanto, nossos resultados mostram que o NO leva a uma redução no nível de GRK2 nos rins durante a sepse, levando à preservação da densidade do receptor a1 adrenérgico o que, juntamente com maior tônus vasoconstritor maior na sepse, leva a vasoconstrição excessiva nos rins e pode contribuir para o desenvolvimento da IRA associada à sepse.Abstract: Sepsis is defined as a life-threatening organ dysfunction caused by an overwhelming immune response to infection. Sepsis clinical findings include vasodilatation and decrease of reactivity to vasoconstrictors leading to severe and untreatable hypotension, being the nitric oxide (NO) an important player in this dysfunction. If in addition to this acute kidney failure (AKI) takes place, the prognostic is worsened. The mechanism of kidney failure in sepsis is under debate. What is known is, in the opposition to the systemic vasculature, renal vascular reactivity to catecholamines is preserved in sepsis. Previous data of our laboratory show that NOS-2-derived NO activates G protein-coupled receptor 2 (GRK2) in aorta and heart, leading to the decrease in a1 and ß1 adrenergic receptor density which, in turn, is associated with the decrease in vascular and cardiac reactivity in sepsis, respectively. Thus, we aimed to study whether the distinct behavior of the kidney was related to NO-GRK2- a1 adrenergic receptor. Female wild type Swiss and C57BL/6 NOS-2-KO mice were submitted to sepsis by cecal ligation and puncture (CLP). Swiss mice were treated with a NOS-2 inhibitor (1400W; 1 mg/kg), 30 min before and 6 and 12 hours after CLP, with a soluble guanylate cyclase inhibitor (methylene blue; 10 mg/Kg), 6, 12 and 18 h after ClP or with a a1 adrenergic receptor antagonist (prazosin; 1 mg/Kg), 12 hours after CLP. In vivo experiments, molecular and biochemistry assays were performed 24 h after CLP. Normal Swiss mice were treated with a NO donor (SNAP, 10 mg/Kg) and analyses were carried out 4 hours later. For complementary experiments, swine kidney epithelial cell line (LLC-PK1) were treated with SNAP (100 µM) in the presence or not of an inhibitor of soluble guanylate cyclase (ODQ, 1 µM) and proteasome inhibitor (MG132,10 µM) and analysis were carried out 4 hours later. Our results show that sepsis decreased the systemic mean arterial pressure, the vascular reactivity to phenylephrine and the basal renal blood flow, which was normalized by treatment with prazosin. Sepsis increased NOS-2 expression in kidney, NO production, NO metabolites and plasm creatinine and urea levels. GRK2 and ß-arrestin levels were decreased whereas a1 adrenergic receptor density increased in septic kidney. The disappearance of renal GRK2 was prevented in NOS-2-KO mice or mice treated with 1400W but not with methylene blue treatment. Angiotensin II receptor density (AT1) did not change in septic kidney. ?1 adrenergic receptor density increased in septic heart while ß-arrestin levels were reduced. Treatment with a NO donor reduced GRK2 content in the kidney of non-septic mice and in LLC-PK1 cells. The decrease in GRK2 level in LLC-PK1 cells was prevented by the inhibition of soluble guanylate cyclase but not with the proteasome inhibitor. Therefore, our results show that a NO-dependent reduction in GRK2 level in the kidney leads to the maintenance of a normal a1 adrenergic receptor density which, together with a higher vasoconstrictor tonus in sepsis lead to vasoconstriction and may help to explain sepsis-induced AKI