Etablierung der Biosynthese von Gibberellinsäurederivaten in Saccharomyces cerevisiae und Anwendung optogenetischer Module in der Grundlagenforschung und Biotechnologie

Die Proteindegradation ist ein zentraler Bestandteil der Regulationsmechanismen in Saccharomyces cerevisiae zur Bewerkstelligung der Proteinhomöostase. Hierbei ist das Ubiquitin-Proteasom-System von fundamentaler Bedeutung und reguliert den Abbau von fehlerhaften Proteinen, sowie solchen, die aufgrund von Zellzyklussignalen oder weiteren Einflüssen für die Degradation bestimmt werden. Die Markierung der für den Abbau bestimmten Proteine geschieht dabei mittels Polyubiquitinierung über eine Kaskade aus drei Enzymen (E1-E2-E3). Das ERAD-System (ER-assoziierte Protein Degradation) ist Teil der Proteinqualitätskontrolle für Proteine des Endoplasmatischen Retikulums (ER) und sekretorischer Proteine. Es sind drei ERAD-Wege bekannt, die je nach Lokalisation des Substrat-Proteins bzw. des beschädigten Teils involviert werden: ERAD-L für ER-luminale Proteine, ERAD-M für ER-Membranproteine und ERAD-C für ER-Membranproteine mit Abbau auslösenden Bestandteilen im Cytosol. Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei ER-Membranproteine Sec61, Sec62 und Sec66 mit C-terminalen cytosolischen Domänen untersucht. Deren optogenetisch kontrollierter Abbau durch das C-terminal angehängte photosenstive Degron (psd) sollte näher charakterisiert werden, um zu überprüfen in wie weit die ERAD-C-Maschinerie an der Proteolyse beteiligt ist. Dabei konnte gezeigt werden, dass der psd-abhängige Abbau von Sec61, Sec62 und Sec66 ubiquitinabhängig ist und neben der Ubiquitin-aktiverenden E1-Ligase Uba1, die dafür notwendigen ubiquitinkonjugierenden E2s Ubc6/ Ubc7 und die E3- Ubiquitinligase Ssm4 aus dem ERAD-C Weg stammen. Der Zellzyklus von S. cerevisiae wird durch das Zusammenspiel unterschiedlicher regulatorischer Proteine gesteuert. In weiteren Untersuchungen dieser Arbeit konnte durch die optogenetische Kontrolle von Zellzyklusregulatoren die heterologe Produktion von sekundären Pflanzenstoffen gesteigert werden. Über den psd-bedingten Abbau der AAA-ATPase Cdc48 und der dominant negativen Mutanten ΔNSic1-psd3 und ClbΔDB-psd3 konnte ein Zellzyklusarrest in der G1- bzw. G2-Phase induziert werden, der zu einer gesteigerten Produktionsrate von β-Carotin aus dem Mevalonat-Weg führte. Weiterhin konnte die Wirksamkeit dieser Module an der heterologen Produktion des pilzlichen Inhaltsstoffs Cordycepin gezeigt werden. Im Zuge dieser Arbeit wurde außerdem der komplexere Biosyntheseweg für das Pflanzenhormon Gibberellinsäure-4 in S. cerevisiae getestet und etabliert. Hierdurch ist eine einfachere Produktion von Gibberellinen als bisher möglich. Da der GA4-Biosyntheseweg ebenfalls aus dem Mevalonat-Weg abzweigt, sind die zuvor getesteten optogenetischen Module ebenfalls für die gesteigerte Produktion von Gibberellinsäure-4 anwendbar