Studio conformazionale di domini funzionali proteici

Il progetto di questo dottorato di ricerca riguarda lo studio conformazionale in soluzione di domini funzionali proteici, mediante l’uso della spettroscopia NMR e di metodi computazionali. In particolare, l’attenzione è stata rivolta allo studio di alcuni fattori di crescita. I fattori di crescita sono proteine coinvolte nella crescita, differenziazione e proliferazione cellulare. Queste proteine possono suddividersi in tre grandi gruppi: IGF (Insulin Growth Factor), FGF (Fibroblast Growth Factor), superfamiglia dei TGF- (Trasforming Growth Factor-beta). La superfamiglia dei TGF- comprende un grande numero di ligandi collegati strutturalmente che giocano un ruolo chiave nella progressione del ciclo cellulare. Un TGF- inizia la trasmissione del segnale (signaling) legandosi a recettori serina/treonina chinasi di tipo I e di tipo II presenti sulla superficie cellulare. In seguito a tale binding, c’è un avvicinamento dei recettori che permette al recettore di tipo II di fosforilare il dominio intracellulare del recettore di tipo I, che poi propaga il segnale attraverso la fosforilazione delle proteine Smad intracellulari. Si forma, quindi, un complesso di proteine Smad che viene traslocato nel nucleo dove va a regolare la trascrizione dei geni target dei TGF-. Poiché la superfamiglia dei TGF- interviene nella crescita e proliferazione cellulare, molti dei suoi membri sono over-espressi, o il loro normale meccanismo è mal regolato, nei casi di crescite anomale di cellule quali i tumori. Proprio questo loro coinvolgimento nella genesi e sviluppo tumorale ha suscitato un grosso interesse scientifico verso lo studio funzionale e strutturale dei TGF-. Tra i numerosi fattori di crescita, una famiglia con caratteristiche particolari è quella chiamata EGF-CFC, di cui la proteina Cripto è il capostipite. I fattori di crescita extracellulari EGF-CFC sono composti da due domini adiacenti ricchi di cisteine: EGF-like (Epidermal Growth Factor-like) e CFC (CRIPTO/FRL-1/Cryptic) di circa 40 residui ciascuno. La proteina Cripto è un elemento fondamentale per il signaling di Nodal, una proteina appartenente ai TGF-. In particolare, Cripto è il co-recettore di Nodal. Infatti, Nodal si lega al complesso recettoriale dell’attivina, formato dai recettori di tipo I (ALK4) e di tipo II (ActRIIB), solo in presenza di Cripto. In questo processo Cripto lega Nodal con il dominio EGF e lega ALK4 con il dominio CFC. Entrambi questi domini di Cripto interferiscono con l’attività onco-soppressiva delle attivine, o bloccando il recettore ALK4 o attraverso il legame all’attivina solubile. Sebbene entrambi i domini siano coinvolti nell’attività tumorigenica di Cripto, il dominio CFC ha un ruolo primario. Data l’importanza che la formazione di questa complessa rete di interazioni riveste, non solo nello sviluppo embrionale, ma anche nella proliferazione di cellule tumorali, è estremamente interessante ottenere informazioni strutturali sui vari fattori proteici coinvolti. Purtroppo, ad oggi, non sono note le strutture tridimensionali né in soluzione né allo stato solido di Cripto, di Nodal e del recettore ALK4. Quindi, nel corso di questo progetto di ricerca è stata intrapresa tale indagine strutturale. In particolare, siamo partiti dallo studio strutturale attraverso NMR in tampone fosfato del dominio CFC da topo e umano. I modelli molecolari ottenuti esibiscono una forma complessivamente ellissoidale e il folding è globalmente esteso con tre strand collegati dai tre ponti disolfuro. E’ importante notare che i residui ritenuti responsabili del binding con il recettore ALK4 (His9 e Trp12) non sono localizzati nel core proteico, ma si ritrovano posizionati tra la fine del primo strand e l’inizio del primo loop, con le catene laterali esposte esternamente. Opposto al sito di binding, è localizzato un cluster di residui idrofobici che potrebbe svolgere una funzione stabilizzante dell’intera struttura proteica attraverso binding col dominio EGF-like, oppure potrebbe essere rilevante per la formazione d’interazioni intermolecolari. Per approfondire lo studio strutturale sull’interazione del dominio CFC con il recettore ALK4, è stato costruito il modello per omologia del dominio extra-cellulare (ECD) di ALK4, basandosi sulla struttura cristallografica del recettore umano ALK3 (identità di sequenza 27 %) ed è stata modellata la struttura tridimensionale del complesso CFC/ALK4-ECD, usando docking macromolecolare assistito da dati sperimentali. Le soluzioni del docking sono state selezionate considerando i risultati degli studi di mutagenesi che indicano i residui H9 e W12 di CFC cruciali per il binding con il recettore ALK4. In base alle analisi condotte è stato scelto un modello rappresentativo del complesso CFC/ALK4-ECD che presenta buona complementarità di superficie, contatti elettrostatici e idrofobici favorevoli, basso valore dell’energia totale. Questo modello, consistente con i dati precedenti di mutagenesi, fornisce una base strutturale per la progettazione di analoghi modificati, che potranno confermare le ipotesi di interazione molecolare tra CFC ed ALK4 ed eventualmente funzionare come antagonisti. Infine, abbiamo puntato la nostra attenzione su Nodal. La proteina Nodal è un omodimero di 220 amminoacidi con 14 cisteine, che formano 6 ponti disolfuro intra-catena e uno inter-catena che lega i due monomeri. E’ stato costruito un modello per omologia sia del monomero sia del dimero della variante umana, utilizzando cinque templati. Il modello di Nodal ottenuto per homology modelling, conserva il nodo di cisteina caratteristico della superfamiglia dei TGF- ed è formato da due -sheet antiparalleli e un -elica perpendicolare ai -sheet. I modelli ottenuti conservano le regioni caratteristiche di binding del recettore di tipo I (‘wrist epitope’) e del recettore di tipo II (‘knucle epitope’) Contemporaneamente, per avere informazioni strutturali in soluzione di Nodal sono stati sintetizzati e caratterizzati tre frammenti, che riproducono tratti di sequenza presumibilmente coinvolti nel legame con i suoi partner proteici. L’ analisi conformazionale NMR evidenzia, nelle condizioni sperimentali adoperate, una fedele riproduzione strutturale dei relativi tratti nella proteina parente. Dall’insieme dei risultati ottenuti, sia mediante NMR che mediante homology modelling, si possono evidenziare elementi strutturali potenzialmente rilevanti per il binding con i recettori o altri partner proteici. In conclusione, questo lavoro di ricerca ha consentito l’acquisizione di informazioni strutturali, finora sconosciute, sulle componenti del complesso proteico che è alla base del meccanismo di signaling di Nodal via Cripto e ha permesso di formulare ipotesi sugli elementi strutturali rilevanti ai fini delle mutue interazioni. Per confermare tali ipotesi è stato avviato uno studio di binding “Real Time Bia” con tecnica Surface Plasmon Resonance (SPR) utilizzando uno strumento BIACORE 3000. Sebbene diversi esperimenti siano stati già condotti, occorrono tuttavia ulteriori prove per arrivare a chiarire il quadro completo di questa complessa rete d’interazioni