Ruolo HIF-1 e NFkB nella regolazione trascrizionale del gene ncx-1 durante l'ischemia cerebrale

Gli obiettivi del presente progetto di ricerca saranno di : (1) studiare l'attività trascrizionale di HIF-1alfa sul promotore di NCX Br-1; (2) studiare l'attività trascrizionale di NFkB sul promotore di NCX Br-1; (3) studiare il possibile coinvolgimento dell'enzima nucleare PARP come attivatore trascrizionale nella regolazione dell'espressione del gene per NCX1. Tali obiettivi saranno perseguiti utilizando linee cellulari continue di neuroblastoma umano SH-SY5Y e di feocromocitoma di ratto PC12 sottoposte a trattamento con CoCl2 e TNF&#945 per indurre in esse l'attivazione di HIF-1&#945 e NFkB rispettivamente. Inoltre, le stesse cellule saranno sottoposte a deprivazione di Ossigeno e Glucosio (OGD) al fine di riprodurre in vitro una condizione simile a quella ottenuta in vivo durante l'ischemia cerebrale. La regolazione della trascrizione del gene di NCX1 verrà studiata utilizzando un approccio basato sull' impiego di un reporter a luciferasi. Questa metodica sfrutta la capacità dell' enzima luciferasi di emettere luce durante l' ossidazione del suo substrato chimico, luciferina. Una volta che il promotore di interesse venga subclonato a monte del gene della luciferasi in un vettore di espressione ed una volta che questo costrutto venga transfettato in un appropriato ospite cellulare, l' espressione della luciferasi e la quantità di luce emessa in presenza di una quantità fissa di luciferina sarà dipendente dall' attività trascrizionale di questo promotore. Per tale ragione, allo scopo di esplorare la regolazione del gene NCX1 subcloneremo nel vettore pGL3basic vector (Promega) il promotore di NCX1 che abbiamo di recente clonato con un approccio in PCR da DNA genomico estratto dalla coda di ratto. In particolare abbiamo amplificato un frammento di 1231 bp che comprende 1080 bp a monte e 150 bp a valle del nucleotide di inizio della trascrizione (+1). Il costrutto così ottenuto verrà transfettato in cellule PC-12 e/o SH-SY5Y. Le cellule verranno lisate 48 ore dopo la transfezione, il lisato verrà incubato con la luciferina e la luce emessa verrà determinata con un luminometro. Questi esperimenti forniranno una stima della trascrizione basale di NCX1 nel nostro sistema