ANALISI DEI MECCANISMI DI SOPRAVVIVENZA CELLULARE DI EUCARIOTI MEDIANTE STRATEGIE DI PROTEOMICA

Il presente progetto è indirizzato allo studio a livello molecolare dei meccanismi di sopravvivenza cellulare mediante l’utilizzo di approcci proteomici integrati. All’interno del progetto è possibile delineare due linee di svolgimento che ricalcano essenzialmente i due approcci proteomici alternativi e complementari, la proteomica di espressione e la proteomica funzionale. In particolare, le metodologie proprie della proteomica di espressione saranno applicate allo studio delle variazione del profilo di espressione proteica e delle eventuali modifiche post-traduzionali in diversi sistemi cellulari allo scopo di individuare proteine specificamente coinvolte nella sopravvivenza delle cellule e nella resistenza alla morte indotta dai chemioterapici. Studi dettagliati dei singoli meccanismi molecolari coinvolti nella sopravvivenza cellulare e/o nella resistenza ai chemioterapici saranno condotti negli stessi sistemi cellulari utilizzando le strategie della proteomica funzionale finalizzate alla identificazione delle interazioni proteina-proteina in vivo. Gli studi di proteomica verranno condotti essenzialmente su tre tipi diversi di cellule eucariote, che includono un sistema eucariote semplice come il lievito da utilizzare come modello, e due sistemi complessi costituiti da cellule staminali tumorali e linfociti circolanti di pazienti affetti da malattia di Alzheimer. Saranno condotte analisi differenziali dei profili di espressione dei proteomi di cellule di lievito normali e cellule in apoptosi indotta da alti livello di H2O2 o per azione del Apoptosis-inducing factor (AIF 1). Lo stesso approccio sarà applicato all’analisi comparativa dei proteomi di cellule staminali normali e tumorali in presenza ed in assenza di IL-4 così come nell’identificazione delle proteine coinvolte nella via di traduzione del segnale JAK/STAT. Infine saranno prese in considerazione le variazione nei profili di espressione proteici e nelle modifiche post-traduzionali riscontrate nei linfociti periferici circolanti di pazienti affetti dal morbo di Alzehimer prima e dopo trattamento con insulina. Le analisi prevederanno il frazionamento degli estratti cellulari utilizzando l’elettroforesi bidimensionale seguita dall’identificazione delle proteine selezionale mediante metodologie di spettrometria di massa. Particolare attenzione sarà rivolta agli aspetti quantitativi delle variazioni nel profilo di espressione proteico utilizzando l’elettroforesi bidimensionale differenziale con rivelazione fluorescente (2D-DIGE che permette un’accurata analisi quantitativa e statistica delle variazioni nell’esprezzione di una proteina. Studi sui meccanismi apoptotici mediati da AIF1 nel lievito, l’inibizionedella traduzione del sagnale da parte di SOCS-1 e l’alterazione delle vie apoptotiche in linfociti di pazienti affetti da Ad trattati con insulina saranno effettuati mediante l’identificazione dei partners proteici che in maniera specifica interagiscono con tali effettori. L’identificazione diretta complessi sarà condotta mediante studi di proteomica funzionale utilizzando tecniche di immunoprecipitazione. I complessi proteici contenenti la proteina marcata con l’epitopo formatisi in vivo saranno isolati dagli estratti cellulari mediante tecniche di immunoprecipitazione usando anticorpi anti-tag. Le proteine interagenti saranno risolte mediante SDS e l’identificazione dei partners sarà condotta con approcci di spettrometria di massa