Basi molecolari delle capacità degradative di composti aromatici in Pseudomonas stutzeri OX1 e in Sulfolobus solfataricus P2.

L'inquinamento ambientale è oggi una delle emergenze maggiormente sentite dalla società a causa dei suoi disastrosi effetti sui delicati equilibri degli ecosistemi mondiali e sulla salute umana. Le tecnologie di risanamento ambientale che sfruttano le bioconversioni microbiche degli agenti inquinanti rappresentano una prospettiva scientifica particolarmente interessante, ma lo sviluppo di queste metodiche si basa necessariamente sulla conoscenza delle basi biochimiche, genetiche e molecolari delle vie metaboliche evolute da tali microrganismi. Vari ceppi di Pseudomonas hanno la capacità peculiare di crescere su sostanze aromatiche e/o alogenate utilizzate come unica fonte di carbonio utilizzando vie cataboliche che generalmente sono organizzate in un “upper" e in un "lower" pathway che portano alla formazione di molecole capaci di entrare nel ciclo degli acidi tricarbossilici. Le ossigenasi rappresentano enzimi chiave degli upper pathway poichè attivano la stabile struttura degli anelli aromatici grazie all'aggiunta di gruppi ossidrilici. Nell'ambito di tali studi il batterio Pseudomonas stutzeri OX1 riveste una particolare importanza poiché mostra una attività ossigenasica di ampio spettro. Nel batterio sono stati individuati i locus genici che codificano per due complessi monoossigenasici: ToMO (toluene/ o-xylene monooxygenase) e PH (phenol hydroxylase). E' stato dimostrato che entrambi i complessi agiscono attraverso una catena di trasporto elettronico che trasferisce gli elettroni dal NAD(P)H al sito attivo del complesso responsabile dell'ossidrilazione delle molecole aromatiche. Per spiegare la co-presenza dei due complessi, sono state espresse e purificate le proteine appartenenti al complesso PH e ne è stata fatta una preliminare caratterizzazione cinetica. Per confrontare le diverse specificità di substrato sono stati effettuati saggi su cellule di E.coli esprimenti i due complessi utilizzando benzene e fenolo quali substrati modello. I dati contenuti nel presente lavoro di tesi hanno consentito di avanzare l'ipotesi che la copresenza dei due complessi non sia ridondante ma aumenti l'efficienza d'utilizzo dei substrati non ossidrilati . Un futuro impiego biotecnologico di Pseudomonas stutzeri OX1 comporta inoltre lo studio delle componenti strutturali e dei meccanismi d'azione mediante i quali tale batterio interagisce con l'ambiente circostante. Sono state conseguentemente effettuate delle analisi strutturali sui lipopolisaccaridi e sui lipooligosaccaridi della membrana di P.stutzeri OXI che evidenziano modificazioni peculiari degli LPS di membrana che farebbero parte di un complesso meccanismo di difesa contro l'eccessiva entrata di composti aromatici nell'ambiente citoplasmatico. Nell'ambito di questa tesi sono state inoltre effettuate delle analisi volte ad analizzare la presenza di una nuova monoossigenasi nel batterio ipertermofilo Sulfolobus solfataricus P2. Analisi di omologia sul genoma di tale batterio, hanno permesso di individuare la presenza di un cluster genico costituito da ORFs che mostrano interessanti omologie con le subunità di altre monoossigenasi batteriche.Sono state perciò effettuate delle prove di crescita in terreno minimo, che hanno consentito di dimostrare che Sulfolobus solfataricus P2 è in grado di usare il fenolo come unica fonte di carbonio e di energia a 80°C. Si è in seguito proceduto al clonaggio, all'espressione e alla caratterizzazione della proteina codificata da una delle ORFs del cluster. I dati riportati dimostrano che si tratta di una ferredossina Rieske-type che, nella catena di trasporto elettronico mediante il quale dovrebbe agire anche questo nuovo complesso, è responsabile del passaggio degli elettroni dalla NADH-ossidoreduttasi al subcomplesso ossidrilasico. Questi dati, oltre ad esperimenti di RT-PCR effettuati su cellule cresciute in presenza di fenolo, consentono di avanzare l'ipotesi che la monossigenasi individuata sia probabilmente attiva anche in vivo