La glucosio-6-fosfato deidrogenasi in orzo (Hordeum vulgare): aspetti biochimici in risposta alla nutrizione azotata ed allo stress salino e confronto con l’enzima dall’alga verde unicellulare Chlorella sorokiniana

La via del pentoso fosfato (OPPP) genera il potere riducente necessario per la riduzione del nitrito e per l’organicazione dell’ammonio. La reazione catalizzata dalla GOGAT nei tessuti non fotosintetici necessita dello shunt del pentoso fosfato come fonte di potere riducente. Il principale enzima della OPPP è la glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PDH). In tutte le piante finora studiate sono state trovate diverse isoforme della G6PDH: una citosolica (Cy-G6PDH) e due compartimentate: cloroplastica (P1-G6PDH) e plastidiale (P2-G6PDH). L’attività della G6PDH, in particolare nell’isoforma cloroplastica, è regolata da vari fattori, tra cui la luce, i composti riducenti, il rapporto NADPH/NADP+. L'enzima citosolico è scarsamente sensibile ai cambiamenti del potere riducente e collegato al metabolismo basale della cellula. L’attività G6PDH aumenta nelle radici di piante d’orzo cresciute su azoto, mentre nelle foglie l’attività non subisce variazioni nelle diverse condizioni di nutrizione azotata. L’aumento osservato nelle radici dopo l’aggiunta di azoto è in parte dovuto alla comparsa dell’isoforma P2-G6PDH, come confermato dai Western blots. Le piante necessitano di nutrienti minerali per crescere e svilupparsi. Tuttavia, un eccesso di sali solubili nel terreno provoca danni consistenti: un suolo che accumula una quantità eccessiva di sali minerali altera il potenziale idrico del suolo e causa degli inconvenienti di natura osmotica alle radici. Una delle risposte più immediate della pianta allo stress salino è la sintesi di osmoliti, composti caratterizzati da particolari proprietà la cui sintesi richiede potere riducente (NADPH). Ciò suggerisce quindi una correlazione tra la via del pentoso fosfato e la sintesi di osmoliti. L’aggiunta di cloruro di sodio al terreno di coltura provoca un raddoppio dell’attività della G6PDH nelle radici di piante di orzo, indipendentemente dall’aggiunta di nitrato. Nelle radici di orzo cresciute in assenza di azoto è presente una sola isoforma della G6PDH; questa proteina reagisce specificamente contro gli anticorpi monoclonali della isoforma citosolica ed i parametri cinetici sono simili a quelli misurati per la Cy-G6PDH in altre piante. Nelle piante nutrite con azoto è possibile purificare una seconda isoforma della G6PDH che reagisce contro gli anticorpi per l’isoforma plastidiale. L’isoforma plastidiale è caratterizzata da una minore affinità per il G6P e soprattutto da una tolleranza agli alti livelli di NADPH. Nelle radici di piante di orzo lo stress provoca nelle due isoforme presenti, la Cy-G6PDH e la P2-G6PDH, effetti molto simili, quali l’aumento di affinità per il G6P e l’aumento della KiNADPH, e quindi della tolleranza agli alti livelli di riducenti presenti in condizioni di stress. L’attività della G6PDH nell’alga verde Chlorella sorokiniana non varia apprezzabilmente sia in assenza che in presenza di azoto ed è possibile purificare una singola isoforma della G6PDH, che presenta delle caratteristiche cinetiche variabili con le condizioni di nutrizione azotata. La G6PDH parzialmente purificata da Chlorella mostra parametri cinetici simili a quelli della isoforma P2-G6PDH delle piante superiori. L’isolamento della frazione cloroplastica e la purificazione della G6PDH dagli organelli isolati, gli zimogrammi per l’attività G6PDH e l’analisi Western dimostrano la localizzazione unicamente cloroplastica della G6PDH di Chlorella (che riconosce solo gli anticorpi per la P2-G6PDH). Inoltre una bassa KmG6P e una differente sensibilità al NADPH suggeriscono una differente struttura biochimica. La principale caratteristica è rappresentata dalla bassa sensibilità all’inibizione da NADPH (KiNADPH = 103 µM) simile a quello osservato per la P2-G6PDH. Inoltre l’enzima risulta avere una bassa sensibilità verso la luce e gli agenti riducenti, tipica delle isoforme citosoliche delle piante, ma non di quelle cloroplastiche, presentando quindi caratteristiche ibride rispetto a quelle delle isoforme compartimentate delle piante superiori. La G6PDH purificata da Chlorella possiede inoltre 9 cisteine per subunità rispetto alle 6 note nelle piante superiori. Quindi, la G6PDH algale presenta caratteristiche che potrebbero far supporre che tale enzima rappresenti un antenato delle isoforme compartimentate delle piante superiori, che si sono successivamente specializzate e differenziate