Effects of high glucose induced-expression of microRNA-31 on fibroblasts adhesion and migration.

Diabetes Mellitus (DM) é uma doença complexa, caracterizada pela hiperglicemia crônica. Muitas complicações estão associadas ao DM duradouro, dentre elas a cicatrização deficiente de feridas. O estresse oxidativo é um dos principais mecanismos envolvidos nas complicações do DM. Demonstramos previamente que células expostas a uma concentração elevada de glicose (HG) apresentam menor velocidade, maior número de protrusões celulares simultâneas e não produtivas (retráteis) e direcionalidade reduzida, por mecanismos que envolvem agentes oxidantes. MicroRNAs são reguladores pós-transcricionais da expressão gênica que promovem a degradação de mRNAs alvo, ou bloqueiam sua tradução. Alguns microRNAs podem afetar a migração celular, como o miR-31. A expressão de miR-31 está aumentada em fibroblastos sob condições hiperglicêmicas (in vivo e in vitro), por mecanismos relacionados ao estresse oxidativo. A superexpressão de miR-31 em fibroblastos aumentou o número de protrusões celulares improdutivas e simultâneas e reduziu a direcionalidade de migração, sem afetar a velocidade celular. O objetivo deste estudo foi elucidar os mecanismos pelos quais o miR-31 afeta a migração de fibroblastos em condições que simulam, in vitro, a normoglicicemia e a hiperglicemia. Para isso, fibroblastos da linhagem NIH-3T3 foram cultivados em baixa concentração de glicose (5 mM) ou HG (30 mM) durante 3 dias. O papel de espécies reativas de oxigênio (EROs) na migração foi avaliado com a adição do antioxidante N-acetil cisteína (NAC) ao meio. Experimentos funcionais foram realizados após superexpressão (com miR mimic) ou supressão (com anti-miR) de miR-31-5p. A expressão de miR-31 foi estudada por PCR em tempo real e o comportamento migratório foi avaliado por time-lapse. A dinâmica de adesões (número, tamanho, circularidade, classificação e localização) foi estudada por microscopia TIRF em células transfectadas com paxilina fluorescente. A expressão de alvos potenciais foi estudada por western blotting e a validação dos alvos foi feita por ensaios de luciferase. Os resultados mostraram que a supressão de miR-31 reduziu a velocidade celular e aumentou a direcionalidade de migração, aumentando a estabilidade de protrusões e a formação de feixes contráteis de actina e miosina II. Semelhante à HG, a superexpressão de miR-31 reduziu o número e tamanho das adesões, com predominância de adesões nascentes (imaturas) sobre a fibronectina. A supressão de miR-31 promoveu a maturação das adesões, aumentando o número e tamanho de adesões focais, sem influenciar a formação de novas adesões. HG reduziu a expressão de ROCK1 e Radixina, sem alterar ROCK2 e integrina 5, por mecanismo dependente de EROs. A superexpressão de miR-31 reduziu a expressão de ROCK1, ROCK2 e Radixina, enquanto a supressão de miR-31 teve o efeito contrário. Radixina foi identificada como alvo direto de miR-31, enquanto ROCK1 foi identificada como alvo indireto. Conclusão: A expressão aumentada de miR-31 em fibroblastos expostos a uma concentração elevada de glicose, estimulada por EROs e tendo como alvos a Radixina (direto) e ROCK1 (indireto), prejudica a migração por diminuição da maturação de adesões celulares junto à matriz extracelular, causando uma perda na estabilidade dos lamelipódios e diminuição da persistência direcional da migração, além de reduzir a contratilidade celular.Diabetes Mellitus (DM) is a complex disease characterized by chronic hyperglycemia. Several complications are associated with long-term DM, including impaired wound healing. Oxidative stress is one of the major mechanisms involved in such complications. We have previously demonstrated that cells exposed to high glucose concentrations (HG) show reduced velocity, increased number of simultaneous unproductive (retractile) cellular protrusions, and reduced directionality by mechanisms involving oxidizing agents. MicroRNAs are post-transcriptional regulators of gene expression that promote the degradation of target mRNAs or block their translation. Some microRNAs modulate cell migration, such as miR-31. MiR-31 expression is increased in fibroblasts under hyperglycemic conditions (in vivo and in vitro) by mechanisms related to oxidative stress. Superexpression of miR-31 in fibroblasts increased the number of unproductive simultaneous cell protrusions and reduced cellular directionality during migration, without effects on cell velocity. This study aimed to elucidate the mechanisms underlying miR-31 effects on cell migration under in vitro conditions that simulate normoglycemic and hyperglycemic environments. NIH-3T3 fibroblasts were cultured in a medium containing a physiological glucose concentration (5 mM) or HG (30 mM) for 3 days. The role of reactive oxygen species (ROS) on cell migration was assessed by adding the antioxidant N-acetyl cysteine (NAC) to the medium. Functional experiments were performed by superexpression (using miR mimic) and suppression (using anti-miR) of miR-31-5p. MiR-31 expression was measured by real-time PCR, whereas migratory behavior was studied using time-lapse videos. Adhesion dynamics (size, circularity, characterization, and localization) were studied by TIRF microscopy after cell transfection with fluorescent Paxillin, a cell adhesion protein. Protein expression of potential miR-31 targets was analyzed by western blotting, and target validation was performed by luciferase assays. Results showed that the suppression of miR-31 reduced cell velocity and increased cell directionality, improving cellular protrusions stability as well as the formation of intracellular actomyosin contractile bundles (stress fibers). Similar to HG, the overexpression of miR-31 reduced the number and size of adhesions to fibronectin, with the predominance of nascent immature adhesions over mature focal adhesions (almost inexistent). The suppression of miR-31 promoted adhesion maturation, increasing the number and size of focal adhesions without effects on new adhesions formation. HG reduced the expression of ROCK1 and Radixin, without effects on ROCK2 and 5 integrin, through a ROS-dependent mechanism. Superexpression of miR-31 also reduced ROCK1, ROCK2, and Radixin expression, while miR-31 suppression produced the opposite results. Radixin was validated as a direct target of miR-31, whereas ROCK1 was identified as an indirect target. Conclusion: ROS-dependent increased miR-31 expression in fibroblasts exposed to a high glucose concentration, through its targets Radixin (direct) and ROCK1 (indirect), impair cell migration by reducing cell contractility, inhibiting adhesion maturation to the extracellular matrix, impairing lamellipodia stability, and reducing directional migration persistence