Expansion of NK cells with high anti-tumor activity: applications in adoptive immunotherapy and involving immunologic mechanisms.

Tem-se, atualmente, especial interesse pelo uso de células Natural Killer (NK) para imunoterapia celular no tratamento de pacientes com doença hematológica maligna e tumores sólidos. No entanto, a transferência adotiva de células NK apresenta limitações, como dificuldade em se obter número suficiente de células para tratamento, persistência inadequada, fraca expansão in vivo e limitada atividade antitumoral das células infundidas. Assim, um desafio nesse campo é a obtenção de células NK em quantidade e qualidade apropriadas para a imunoterapia adotiva. Aqui, apresentamos uma proposta inovadora para a produção em larga escala de células NK provenientes do sangue de cordão umbilical (CB-NK), com aumento de atividade antitumoral. Baseado no fato de que as células NK de sangue periférico apresentam propriedade de memória com aumento de resposta antineoplásica quando estimuladas previamente por uma combinação de citocinas, nós estudamos esse efeito em CB-NK com a intenção de se desenvolver um produto alogênico facilmente disponível para o uso clínico. CB-NK foram submetidas a um breve período de pré-ativação com uma combinação de interleucina-12 (IL-12), IL-15 e IL-18, seguido de expansão usando células feeder K562, expressando IL-21 e CD137 na presença de IL-2 exógena. Células NK pré-ativadas e expandidas (P+E CB-NK) apresentaram aumento da citotoxicidade contra linhagens tumorais mieloides, blastos de pacientes com leucemia mieloide aguda e linfoide após 14 dias de expansão. Por meio de sequenciamento de RNA, observou-se que as células P+E CB-NK apresentaram perfil transcriptômico compatível com ativação de vias de sinalização relacionadas ao aumento da função efetora, mesmo 14 dias após a ativação com a combinação de citocinas. As células P+E CB-NK apresentaram, ainda, aumento de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) em relação às células somente expandidas sem a fase de pré-ativação. As células NK pré-ativadas e expandidas também exibiram aumento da atividade antitumoral com estimulação do anticorpo biespecífico chamado AFM13. Após estável ligação com AFM13, essas células exibiram resposta antitumoral aumentada contra células tumorais de linfoma CD30 + in vitro e in vivo, em modelo experimental com camundongos NSG imunodeficientes. Coletivamente, esses dados identificaram a combinação de AFM13 com P+E CB-NK como uma estratégia promissora para o tratamento de doenças hematológicas CD30+.Currently there is a particular interest in using Natural Killer (NK) cells for cell immunotherapy in the treatment of patients with malignant hematologic disease and solid tumors. However, the adoptive transfer of NK cells has limitations such as difficulty in obtaining a sufficient number of cells for treatment, inadequate persistence, poor in vivo expansion, and limited antitumor activity of the infused cells. Thus, a challenge in this field is to obtain NK cells in adequate quantity and quality for adoptive immunotherapy. Here, we present an innovative proposal for the large-scale production of NK cells from umbilical cord blood (CB-NK) with increased anti-tumor activity. Based on the fact that peripheral blood NK cells have memory properties as an increased anti-neoplastic response when previously stimulated by a combination of cytokines, we studied this effect on CB-NK to develop a readily available allogeneic product for clinical use. CB-NK were pre-activated with a combination of interleukin-12 (IL-12), IL-15 and IL-18 for 16 hours, followed by expansion using K562 feeder cells expressing IL-21 and CD137 in the presence of exogenous IL-2. Pre-activated and expanded NK cells (P+E CB-NK) showed increased cytotoxicity against myeloid tumor lines, primary blasts from patients with acute myeloid leukemia and lymphoid cell line after 14 days of expansion. The P+E CB-BK cells displayed a transcriptomic profile compatible with activation of signaling pathways related to increased effector function, even 14 days after activation with the combination of cytokines in the RNA sequencing analysis. The P+E CB-NK cells also showed an increase in antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) comparing to cells that were only expanded without the pre-activation phase. Pre-activated and expanded NK cells also exhibited increased anti-tumor activity when stimulated with a bispecific antibody called AFM13. After stable binding to AFM13, these cells showed increased anti-tumor response against CD30 + lymphoma cell line in vitro and in vivo in an xenogenic model with immunodeficient NSG mice. Collectively, these data identify the combination of AFM13 with P+E CB-NK as a promising strategy for treating CD30+ hematologic diseases