Study of the transport pathway of water and/or ammonia through urea transporters (UTs) expressed in Lithobates catesbeianus oocytes.

Nos rins, os transportadores de ureia (UTs) são responsáveis por facilitar o transporte de ureia, contribuindo para manter um interstício medular altamente concentrado, importante para os mecanismos de concentração urinária. Os mamíferos possuem dois genes, SLC14A1, que codifica UT-B, e SLC14A2, que gera variantes por splice, UT-A1, A2 e A3. Nos rins, UT-A1 é expresso na membrana apical e UT-A3 na membrana basolateral do ducto coletor medular interno; UT-A2 é expresso no segmento descendente fino da alça de Henle e UT-B nos vasos retos descendentes. A estrutura cristalina do UT-B de bovino (b) revela que o UT é uma proteína homotrimérica e cada monômero funciona como um canal para o transporte de ureia. No centro de cada monômero há um filtro de seletividade que coordena o transporte de ureia a favor do seu gradiente de concentração. Na região mais estreita desse filtro foram identificados dois resíduos de Treonina (Thr ou T) T172 e T334 que formam o sítio de ligação da proteína com a ureia e são conservados em todas as isoformas UT. Dois Trabalhos anteriores demostraram que o UT-B, expresso em níveis elevados em oócitos de Xenopus laevis, não apenas transporta ureia, mas também funciona como um canal para água (YANG; VERKMAN, 1998; GEYER et. al., 2013) e NH3 (GEYER et. al., 2013). Recentemente, nosso laboratório confirmou que UT-B funciona como um canal para água e, demonstrou pela primeira vez que UT-A2 e UT-A3 também são capazes de transportar água, além de ureia. quando expressos em oócitos da rã Lithobates catesbeianus, um sistema de expressão heteróloga de proteínas padronizado em nosso laboratório. Nesse estudo, nós investigamos o efeito do inibidor Floretina e da mutação dos dois resíduos conservados de T por V no transporte de ureia, água e NH3 através das proteínas de camundongo (m) mUT-A2, mUT-A3 e mUT-B. Oócitos de Lithobates foram injetados com cRNA para a expressão de UTs WT versus mutantes [(UT-A2WT vs UT-A2T176V e UT-A2T338V), (UT-A3WT vs UT-A3T246V e UT-A3T408V) e (mUT-BWT vs UT-BT172V e UT-BT334V)] ou injetados com H2O como controle. A expressão heteróloga foi avaliada pela biotinilação das proteínas de superfície, seguida de experimentos de western blot utilizando o anticorpo monoclonal anti-c-Myc. O transporte de ureia foi monitorado através de experimentos de captação de ureia marcada com Carbono14. O transporte de água foi explorado através de experimentos de permeabilidade osmótica à água (Pf), computada através de microscopia de vídeo-imagem do aumento do volume de oócitos expostos à uma solução hipotônica. O transporte de NH3 foi avaliado através da técnica de medidas do pH de superfície (pHS) que utiliza um microeletrodo de vidro com ponta romba, sensível a H+, para medir as variações de pH que ocorrem na superfície dos oócitos devido ao influxo resultante de NH3 [(ΔpHS(NH3)]. Os resultados de western blot de amostras biotiniladas demonstraram que os oócitos de Lithobates são capazes de expressar as proteínas mUT-A2WT, mUT-A3WT e mUT-BWT e os seus respectivos mutantes devido à presença de bandas imunorreativas ao redor de 45-65 kDa, correspondente ao peso molecular de monômeros de UTs glicosilados. As bandas descritas para os UTs estavam ausentes nos blots de amostras biotiniladas de oócitos controle injetado com H2O. Os resultados funcionais demonstraram que os oócitos que expressam mUT-A2WT, mUT-A3WT ou mUT-BWT exibiram valores médios de captação de 14C-ureia, Pf e pHS(NH3) sensíveis ao inibidor Floretina significativamente maiores do que aquelas observados para os oócitos UT mutantes ou controle. Assim, este trabalho mostra pela primeira vez que mUT-A2 e mUT-A3 transportam NH3 e utilizam um filtro de seletividade conservado como mecanismo de transporte comum para ureia, água ou NH3. Acreditamos que alterações na expressão e/ou atividade dessas proteínas nos rins poderiam alterar as permeabilidades à ureia, água e/ou NH3, influenciando, desse modo, os mecanismos renais que integram a excreção de resíduos nitrogenados, água e ácido (NH4+). Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (nº 7971160519).In the kidneys, the SLC14 family of proteins, known as urea transporters (UTs), is responsible for facilitating urea\'s transport, contributing to maintain the high osmolarity of the medullary interstitium, an essential process for the urinary concentrating mechanism. There are two UT genes: SLC14A1, which encodes UT-B, and SLC14A2, which generates splice variants UT-A1, A2 and A3. It has been shown that UT isoforms are expressed in specific renal regions, with UT-A1 and UT-A3 localized in the apical and basolateral membranes of the inner medullar collecting duct, respectively, UT-A2 in the thin descending limb of the Loop of Henle and UT-B in the descending vasa recta and red blood cells. The X-ray crystal structure of bovine UT-B (bUT-B) revealed a homotrimeric quaternary structure, with a urea pore in each monomer. In the pore\'s narrowest region, a selectivity filter with two highly conserved threonine (Thr or T) residues forms the urea binding site. In addition to urea, previous studies demonstrated that bUT-B could also transport water (YANG; VERKMAN, 1998; GEYER et. al., 2013) and NH3 (GEYER et. al., 2013), and Thr to valine (Val or V) mutations in the selectivity filter reduce the transport of all these substances. Moreover, our laboratory recently showed that wild type (WT) mouse (m) UT-A2, mUT-A3 and mUT-B can be heterologously expressed on the surface of Lithobates catesbeianus oocytes, resulting in augmented and phloretin-sensitive urea and water transport. Herein, we investigated the heterologous expression of mouse (m) mUT-A2WT, mUT-A3WT and mUT-BWT and the following Thr to Val mutants mUT-A2T176V, mUT-A2T338V, mUT-A3T246V, mUT-A3T408V, mUT-BT172V and mUT-BT334V. The heterologous expression was evaluated by the biotinylation of the surface proteins, followed by western blot experiments using the monoclonal anti-c-Myc antibody. Urea uptake of the wild-type and mutant proteins was assessed with 14C-Urea, osmotic water permeability (Pf, cm/s) was calculated by monitoring cell swelling with video-image microscopy after exposing the oocytes to a hypotonic solution, and NH3 permeability was measured using a microelectrode with a blunt tip to record the maximum transient NH3-induced change in oocyte surface pH [ΔpHS(NH3)]. Samples of oocytes expressing mUT-A2WT, mUT-A3WT and mUT-BWT and their respective mutations revealed immunoreactive bands around 45 kDa, a value that is consistent with the molecular weight of glycosylated UT monomers. In contrast, immunoblots of biotinylated H2O-injected control oocyte samples had no detectable signals. We also observed that oocytes expressing mUT-A2WT, mUT-A3WT or mUT-BWT exhibited significantly higher and phloretin-sensitive 14C-uptake, Pf and ΔpHS(NH3) average values than the mutants or H2 O-injected control oocytes. Our results indicate that mutating the Thr in the selectivity filter does not affect the UT glycosylation or insertion into the oocyte plasma membrane. However, these mutant proteins display significantly lower urea, water and NH3 transport activities than mUT-A2WT, mUT-A3WT and mUT-BWT. In conclusion, we have shown for the first time that mUT-A2 and mUT-A3 transport NH3 and utilizes a conserved solute selectivity filter. We believe that changes in the expression and/or activity of these proteins in the kidney may modulate the permeability to urea, water and/or NH3, thus influencing the renal mechanisms that integrate the excretion of nitrogenous waste, water and acid (NH4+). All experimental procedures were approved by the Committee on Ethics in the Use of Animals (nr 7971160519)