Desenvolvimento de uma plataforma carreadora de imunógenos heterólogos utilizando vesículas extracelulares fúngicas

Infecções fúngicas sistêmicas vem emergindo ao longo das últimas décadas, acometendo principalmente indivíduos imunocomprometidos. Os fármacos disponíveis atualmente apresentam efeitos colaterais significativos e diversos casos de resistência, além de serem utilizados em protocolos longos, caros e com interações medicamentosas frequentes e perigosas. Por isso, a busca por novas alternativas terapêuticas é urgente. Estudos avaliam a utilização de anticorpos monoclonais e peptídeos antifúngicos. No entanto, esses métodos esbarram, respectivamente, em problemas como baixo espectro de ação e elevado custo. Nesse cenário, a busca por vacinas antifúngicas vem sendo estimulada. Vacinas com “antígeno único” são atualmente utilizadas em testes clínicos; no entanto, problemas de eficácia são observados devido a variabilidade genética e imunológica das diferentes populações, além da própria plasticidade das cepas fúngicas. As propostas atuais sugerem o uso de vacinas multivalentes com forte componente CD8+ e capazes de promover uma resposta de memória frente a diferentes espécies fúngicas. Resultados do nosso grupo mostram que vesículas extracelulares (VEs) produzidas por Cryptococcus neoformans e Candida albicans são capazes de modular a atividade de fagócitos, levando a produção de óxido nítrico e citocinas pró inflamatórias, além de promover a expressão de moléculas co estimulatórias em células dendríticas. Além disso, dados não publicados do grupo, demonstram que a vacinação de camundongos com VEs de C. albicans protegeu os animais de um posterior desafio letal, mesmo na ausência de adjuvantes. Em conjunto, esses resultados sugerem que esses compartimentos ativam a resposta imune inata e pode mediar a resposta adaptativa, suportando o uso das VEs fúngicas como formulações vacinais multiantigênicas. O objetivo deste projeto é desenvolver um modelo de expressão de imunógenos heterólogos carreados por VEs utilizando Saccharomyces cerevisiae, um fungo de fácil manipulação genética e cultivo. A cepa S288C de S. cerevisiae foi transformada com plasmídeo pRS416 contendo sequências quiméricas para expressão da proteína Ovalbumina (OVA) sob regulação de um promotor constitutivo do gene ADH1 de S. cerevisiae. Três sequências foram utilizadas: (i) a sequência completa, chamada solúvel (sOVA), (ii) uma sequência truncada que direciona a proteína preferencialmente para o citoplasma (cOVA), (iii) uma sequênca também truncada, com uma sequência de ferritina adicionada, que direciona a proteína para a membrana (mOVA). A transformação foi realizada pelo método LiAc (acetato de lítio) e a confirmação da expressão de OVA investigada por Western Blot e Imunofluorescência. A expressão da proteína foi confirmada em leveduras de S. cerevisiae sOVA e cOVA, mas somente nas VEs de sOVA. Como já observado para VEs de C. albicans e C. neoformans, VEs de S. cerevisiae foram internalizadas por macrófagos murinos primários. Além disso, VEs de S. cerevisiae induziram a produção de óxido nítrico por macrófagos primários murinos e aumentaram a expressão das moléculas coestimulatórias CD86 e MHC II por células dendríticas. VEs de sOVA aumentaram significativamente a secreção de IL-6 por macrófagos. Células dendríticas, por outro lado, secretaram IL-6 quando incubadas com VEs de vOVA e sOVA. Nossos resultados confirmam ser possível a manipulação do conteúdo proteico de VEs fúngicas. Inserir antígenos nestes compartimentos pode ser uma alternativa para potencializar suas propriedades imunogênicas e seu uso como plataforma vacinal