Investigation of the LRRC8 subunit composition and the activating signal transduction of the volume-regulated anion channel (VRAC)

The volume-regulated anion channel (VRAC) plays a key role in the regulation of osmotic cell volume as well as in various physiological processes such as apoptosis, insulin secretion, cell differentiation, and purinergic signaling. It is formed by hetero-hexamers of members of the leucine-rich repeat-containing protein family 8 (LRRC8), which consists of five members, LRRC8A-E. LRRC8A is the obligatory subunit, and its heteromerization with at least one other LRRC8 paralogue, LRRC8B-E, determines VRAC's biophysical properties. Subunit stoichiometry of VRAC is of physiological importance and largely influences its activation mechanism, as well as its response to regulatory inputs. However, the endogenous tissue-specific subunit composition of VRAC remains unknown. Furthermore, despite extensive research on VRAC's possible physiological functions, there is little consensus on its activation mechanism. In this thesis, I developed and applied a quantitative immunoblot method to quantify the five VRAC LRRC8 subunits in various mouse cell lines and tissues, using glutathione-S-transferase (GST)-tagged recombinant fusion proteins for signal calibration. The subunits showed tissue-specific expression patterns, with relatively low expression of the obligatory LRRC8A subunit. Based on the co-immunoprecipitation of LRRC8B-E in excess with LRRC8A, I concluded that non-LRRC8A subunits predominate in native hetero-hexamers. In light of this information, I estimated ~10,000 VRACs per cell in the tested cell lines, which is consistent with an earlier calculation from the comparison of single-channel and whole-cell currents. Furthermore, I assessed VRAC activity by a Förster-resonance energy transfer (FRET)-based approach upon induction of apoptosis, sphingosine-1-phosphate (S1P)-induced signaling, and glucose feeding in pancreatic β-cells. I found that the pharmacological inhibition of protein kinase D (PKD) impaired the apoptotic-induced VRAC activation. Interestingly, signaling via S1P appeared to be mediated by an alliance between S1P receptors, specifically the Gq-coupled S1P receptors. I proposed that the Gq family of heterotrimeric G-proteins served as central mediators of the diacylglycerol (DAG)-PKD mediated VRAC activation induced by S1P in HeLa cells. PKD may phosphorylate VRAC, thereby activating it. This notion is supported by the observation that hypotonic activation of phospho-ablative LRRC8A mutant 8A-T169A is diminished due to the loss of the putative phosphorylation site. Lastly, I showed that an orphan G protein-coupled receptor (GPCR), GPCR5B, adversely modulated the VRAC activity in rat pancreatic β-cells, which may affect β-cell survival and insulin secretion. All in all, these results indicate a possible signaling pathway of VRAC activation, highlighting the importance of membrane-localized GPCRs and G-proteins in signal transduction.Die volumenregulierten Anionenkanäle (VRAC) spielen eine Schlüsselrolle bei der osmotischen Regulation des Zellvolumens sowie bei verschiedenen physiologischen Prozessen wie Apoptose, Insulinsekretion, Zelldifferenzierung und purinerger Signalübertragung. Es wird von Hetero-Hexameren der Leucine-Rich Repeat-Containing Protein Family 8 (LRRC8) gebildet, die aus fünf Mitgliedern, LRRC8A-E, besteht. LRRC8A ist die obligatorische Untereinheit, und ihre Heteromerisierung mit mindestens einem anderen LRRC8-Paralog, LRRC8B-E, bestimmt biophysikalische Eigenschaften von VRAC. Die Untereinheiten-Stöchiometrie von VRAC ist von physiologischer Bedeutung und beeinflusst weitgehend seinen Aktivierungsmechanismus sowie seine Reaktion auf regulatorische Signale. Die endogene gewebespezifische Untereinheitenzusammensetzung von VRAC ist jedoch weitestgehend unbekannt. Darüber hinaus gibt es trotz umfangreicher Forschung über die möglichen physiologischen Funktionen von VRAC wenig Konsens darüber, wie er aktiviert wird. In dieser Arbeit habe ich eine quantitative Immunoblot-Methode entwickelt und angewandt, um die fünf VRAC LRRC8-Untereinheiten in verschiedenen Maus-Zelllinien und -Geweben zu quantifizieren, wobei rekombinante Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST)-Markierung zur Signalkalibrierung verwendet wurden. Die Untereinheiten zeigten gewebespezifische Expressionsmuster, mit relativ geringer Expression der obligatorischen Untereinheit LRRC8A. Basierend auf der Co-Immunpräzipitation von LRRC8B-E im Überschuss mit LRRC8A schloss ich, dass Nicht-LRRC8A-Untereinheiten in nativen Hetero-Hexameren überwiegen. In Anbetracht dieser Informationen berechnete ich das Vorkommen auf ~10.000 VRACs pro Zelle in den getesteten Zelllinien, was mit einer früheren Berechnung aus dem Vergleich von Einzelkanal- und Ganzzellströmen übereinstimmt. Darüber hinaus habe ich die VRAC-Aktivität mittels Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-basiertem Ansatz bei der Induktion von Apoptose, Sphingosin-1-Phosphat (S1P)-induzierter Signalgebung und Glukose-Stimulation in pankreatischen β-Zellen untersucht. Ich fand heraus, dass die pharmakologische Hemmung der Proteinkinase D (PKD) die apoptose-induzierte VRAC-Aktivierung beeinträchtigte. Interessanterweise wird die Signalisierung durch S1P über eine Allianz zwischen S1P-Rezeptoren, speziell den Gq-gekoppelten S1P-Rezeptoren, vermittelt. Dies deutet darauf hin, dass die Gq-Familie der heterotrimeren G Proteine als zentrale Vermittler der durch S1P induzierten Diacylglycerol (DAG)-PKD-vermittelten VRAC-Aktivierung in HeLa-Zellen dienen. PKD kann VRAC phosphorylieren und ihn dadurch aktivieren. Diese Vorstellung wird durch die Beobachtung unterstützt, dass die hypotone Aktivierung der phospho-ablativen XV LRRC8A-Mutante 8A-T169A aufgrund des Verlustes der möglichen Phosphorylierungsstelle vermindert ist. Schließlich habe ich gezeigt, dass einn orphan G Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR), GPCR5B, die VRAC-Aktivität in pankreatischen β-Zellen der Ratte negativ moduliert und damit das Überleben der β-Zellen und die Insulinsekretion beeinflusst. Alles in allem weisen diese Ergebnisse auf einen möglichen Signalweg der VRAC-Aktivierung hin und unterstreichen die Bedeutung von membranständigen GPCRs und G Proteinen in der Signaltransduktion