Phytochemical analysis of native Crepis spp.

The genus Crepis L. (Asteraceae / Compositae) comprises more than 250 currently recognized species and is distributed throughout the northern hemisphere and Africa, with the Mediterranean area being the most important center of its diversification. Today, less than 10% of the species have been investigated either from a phytochemical or a bioactivity point of view.The genus has been reported rich in sesquiterpene lactones and especially guaianolides, with other terpenoids also being identified, such as triterpenes and sterols. Another widespread group of specialized natural products is phenolics and flavonoids, with predominant compounds being caffeoyl and luteolin derivatives, respectively. The consensus view of specialized herbal metabolites as promising medicinal agents for preventing or managing oxidative stress, inflammation, hyperlipidaemia, and other related disorders, has been shown by their ability to maintain good health and to retard aging processes. Even though phytoconstituents of Crepis genus have been documented, its pharmacological potential has not yet been fully explored. Extracts obtained from various parts of the Crepis spp. and their isolated constituents have undergone limited evaluation as antitumor, anti-inflammatory, antiviral, antimicrobial, antiulcer, antioxidant, and nutritional supplements. Moreover, within the Crepis genus, are few edible representatives, such as C. commutata, C. foetida, C. setosa and C. vesicaria.In this context, nine species were collected from different areas in Greece, specifically Crepis auriculifolia, C. commutata, C. dioscoridis, C. foetida, C. heldreichiana, C. incana, C. rubra, C. sibthorpiana and Phitosia crocifolia (formerly known as Crepis crocifolia). These samples were extracted and further investigated for their chemical profile and their biological effects. It is worth mentioning that among the selected plants Crepis auriculifolia, C. heldreichiana, C. incana, C. sibthorpiana and Phitosia crocifolia account for narrowly endemic types with limited distribution.Phytochemical analysis was conducted via extraction, isolation, and identification of secondary metabolites and qualitative analysis of their extracts aiming to characterize the chemical load of the plants. Selected extracts, fractions, and substances were studied in order to evaluate their cytotoxic, antioxidant, anti-inflammatory, and anti-hyperlipidaemic activity. To determine the constituents of the above-mentioned plant extracts, sample measurements were carried out by using chromatographic techniques (CC, VLC, HPLC, etc), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC- MS), and gas chromatography with mass spectrometry (GC-MS).A total of forty-seven natural products were isolated from Cy-hex:Et2O:MeΟH 1:1:1 and MeOH:H2O 5:1 extracts; twenty-eight components belong to the group of sesquiterpene lactones (1-28), among them with ten new natural products. Sixteen compounds are phenolic derivatives: seven are simple phenolics (32-35,37-39), one caffeoylquinic acid (40) and one is a salicin derivative (36), five are flavonoids (41-45), one is a coumarin derivative (46) and one is a lignan (47). Two triterpenes (29-30) and a nor-isoprenoid (31) were also isolated. In addition, the polar extracts (MeOH:H2O 5:1) of all species were studied through LC-MS and a total of fifty-two components were identified, while the volatile components of the widespread species, C. foetida subsp. foetida, and C. rubra were studied through GC-MS with thirty-nine components being identified.Biological assays:•Volatile fractionWe investigated the volatile fraction of C. foetida flowers (CFA) obtained by hydro-distillation, rich in the salicylic aldehyde, for its anti-inflammatory activity through the inhibition of TNF- α-induced ICAM-1 expression. CFA showed a strong reduction of ICAM-1 expression by 65- 70%, across the range of tested concentrations, without showing any cytotoxic effect.•Cy-hex: Et2O:MeΟH 1:1:1 extractsA.Using the MTT cytotoxicity assay, we investigated the extracts obtained with Cy-hex: Et2O:MeΟH 1:1:1 of the species Crepis auriculifolia, C. commutata, C. incana, C. foetida, C. rubra, C. sibthorpiana and Phitosia crocifolia in human cervical adenocarcinoma cells (HeLa). Moreover, fractions rich in sesquiterpene lactones were selected. The most active fractions showed IC50 from 9.4 to 23.7 µg/mL. Α plant extract is considered to have potent in vitro cytotoxic activity if the IC50 value is less than 20 µg/mL after incubation for 48 and 72 h. Consequently, the studied fractions have strong cytotoxic activity against HeLa cells and could be a potential source of cytotoxic natural products. This was confirmed in the 2nd stage of the experiment, where the pure substances grossheimin (1), 8 epi-grossheimin (2), intergrifolin (4) taraxinic acid (26), phitosin A (13), tanapraetenolide (21), 2-oxo-11-hydroxy-13β-dihydrosandamarin (24), 2β-hydroxysandamarin (17), 8-epi-iso-amberboin (3), 8-epi-isolipididiol (11), integrifolin (4) and 11β,13- dihydro-integrifolin (10) were studied. Among them, substances 4, 26, 1 and 21 showed strong activity with IC50 values of 5.5, 6.5, 9.5 and 10.4 µM, respectively.B.The in vitro metabolism of two sesquiterpene lactones (parthenolide and grossheimin) was analysed using human liver microsomes. More specifically, for parthenolide, five metabolites were found in phase I and in the combined metabolism of phases I and II one glucuronosylated metabolite. For grosheimmin (1), four metabolites were detected in phase I and two metabolites with glucuronic acid in phase II.•MeOH:H2O 5:1 extractsIn addition, we hereby examined the polar extracts, which are more likely to contain polar compounds more relevant to their local use as edible green herbs and also potentially potent antioxidant agents. Thus, the present study further includes a bio-guided approach using antioxidant, anti-inflammatory and hypolipidaemic assays, to unveil the most promising plant extract(s), through both in vitro (Radical Scavenging of DPPH and Total Phenolic Content-Folin Ciocalteu) and in vivo (Paw Oedema Reduction and Hypolipidaemic Activity - experimental mouse protocols) procedures. Initially, the antioxidant activity and the determination of the total polyphenolic content were evaluated in nine samples, from which the most active was selected for further fractionation (C. incana). The resulting fractions were re- evaluated with the same methods, and the next step was to evaluate the extracts and fractions in vivo, in mice models of inflammation and hyperlipidaemia. Among the extracts tested, C. incana presented in vitro the highest gallic acid equivalents (GAE) (0.0834 mg/mL) and the highest antioxidant activity (IC50 = 0.07 mg/mL), as well as the highest anti-inflammatory activity in vivo with 32% paw oedema reduction. Furthermore, in the hypolipidaemic protocol, the same extract increased plasma total antioxidant capacity (TAC) by 48.7% and reduced cholesterol (41.3%), as well as triglycerides (37.2%).Το γένος Crepis L. ανήκει στην οικογένεια Asteraceae (Compositae) και περιλαμβάνει περίπου 250 είδη, τα οποία ενδημούν στις εύκρατες περιοχές του βόρειου ημισφαιρίου και στην τροπική Αφρική, με μεγαλύτερη ποικιλομορφία ειδών στην περιοχή της Μεσογείου. Σήμερα, λιγότερο από το 10% των ειδών έχουν ερευνηθεί είτε από φυτοχημική είτε από άποψη βιοδραστικότητας. Επιπλέον, στο γένος Crepis, εμφανίζονται εδώδιμοι εκπρόσωποι, όπως τα είδη C. capillaris, C. commutata, C. foetida, C. setosa και C. vesicaria. Το γένος έχει αναφερθεί πλούσιο σε σεσκιτερπενικές λακτόνες και ιδιαίτερα σε γουαϊανολίδια, ενώ έχουν εντοπιστεί και άλλα τερπένια, όπως τριτερπένια και στερόλες. Μια άλλη ευρέως διαδεδομένη ομάδα φυσικών προϊόντων είναι τα φαινολικά και τα φλαβονοειδή, με κυρίαρχες ενώσεις τα παράγωγα του καφεϊκού οξέος και της λουτεολίνης, αντίστοιχα.Παρόλο που τα φυτοχημικά συστατικά του γένους Crepis έχουν αξιολογηθεί και βιβλιογραφικά έχει καταδειχθεί η αξία τους ως πολλά υποσχόμενες πηγές σεσκιτερπενικών λακτονών, το φαρμακολογικό δυναμικό του γένους δεν έχει ακόμη διερευνηθεί πλήρως. Εκχυλίσματα που έχουν ληφθεί από τα διάφορα είδη Crepis και τα απομονωμένα συστατικά τους έχουν υποβληθεί σε περιορισμένη φαρμακολογική αξιολόγηση ως αντιικά, αντιμικροβιακά, αντιελκωτικά, αντιοξειδωτικά, αντιφλεγμονώδη και κυτταροτοξικά μέσα.Οι εξειδικευμένοι δευτερογενείς μεταβολίτες είναι πολλά υποσχόμενοι φαρμακευτικοί παράγοντες για την πρόληψη ή τη διαχείριση πολλών διαταραχών. Ο ρόλος του οξειδωτικού στρες σε παθολογικές καταστάσεις και η εμπλοκή του σε οξείες και χρόνιες φλεγμονώδεις διαταραχές, συμπεριλαμβανομένων της αθηροσκλήρωσης, του διαβήτη και του καρκίνου, είναι καλά τεκμηριωμένος. Έτσι, σε συσχέτιση με το χημικό προφίλ του γένους, στοχεύσαμε να εντοπίσουμε παράγοντες κυτταροτοξικότητας και παράγοντες για την αντιμετώπιση του οξειδωτικού στρες, της φλεγμονής και της δυσλιπιδαιμίας μέσα από δυνητικά δραστικά φυσικά προϊόντα, όπως εκχυλίσματα ή ενώσεις, που θα μπορούσαν ενδεχομένως να χρησιμεύσουν σε σχετικές διαταραχές.Στο πλαίσιο αυτό, συλλέχθηκαν από διαφορετικές περιοχές της Ελλάδας και μελετήθηκαν εννέα είδη: Crepis auriculifolia Spreng, C. commutata (Spreng.) Greuter, C. dioscoridis L., C. foetida L., C. heldreichiana (Kuntze) Greuter, C. incana Sm., C. rubra L., C. sibthorpiana Boiss. & Heldr. και Phitosia crocifolia Kamari & Greuter (πρώην γνωστό ως Crepis crocifolia). Αυτά τα δείγματα εκχυλίστηκαν και διερευνήθηκαν περαιτέρω για το χημικό τους προφίλ και τις βιολογικές τους δράσεις. Αξίζει να αναφερθεί ότι από τα επιλεγμένα φυτά, τα C. auriculifolia, C. heldreichiana, C. incana, C. sibthorpiana και Phitosia crocifolia αντιπροσωπεύουν στενά ενδημικούς τύπους με περιορισμένη εξάπλωση.Διεξήχθη φυτοχημική ανάλυση, ήτοι απομόνωση, ταυτοποίηση των δευτερογενών μεταβολιτών και ποιοτική ανάλυση των εκχυλισμάτων τους με στόχο τον χαρακτηρισμό του χημικού φορτίου των φυτών. Επιλεγμένα εκχυλίσματα, κλάσματα και ουσίες μελετήθηκαν σε βιολογικούς ελέγχους για την αξιολόγηση της κυτταροτοξικής, αντιοξειδωτικής, αντι- φλεγμονώδους και αντιυπερλιπιδαιμικής δράση τους. Για τον προσδιορισμό των συστατικών των προαναφερθέντων φυτών πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις χρησιμοποιώντας χρω- ματογραφικές τεχνικές (CC, VLC, HPLC κ.λπ.), φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), υγρή χρωματογραφία σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζης (LC-MS) και αέρια χρωματογραφία με φασματομετρία μάζης (GC-MS).Φυτοχημική ανάλυση - Βιολογικές δοκιμασίεςΣχετικά με την φυτοχημική ανάλυση, συνολικά απομονώθηκαν σαράντα εφτά φυσικά προϊόντα από τα εκχυλίσματα Cy-hex:Et2O:MeΟH 1:1:1 και MeOH:H2O 5:1, εκ των οποίων είκοσι οκτώ συστατικά ανήκουν στην ομάδα των σεσκιτερπενικών λακτονών (1-28) με δέκα νέα φυσικά προϊόντα, δέκα έξι ανήκουν στα φαινολικά παράγωγα, από τα οποία εφτά είναι απλά φαινολικά (32-35,37-39), ένα καφεοϋλοκινικό (40) και ένα παράγωγο σαλικίνης (36), πέντε φλαβονοειδή (41-45), μία κουμαρίνη (46) και ένα λιγνάνιο (47). Επίσης απομονώθηκαν δύο τριτερπένια (29-30) και ένα νορ-ισοπρενοειδές (31). Επιπλέον, μελετήθηκαν τα πολικά εκχυλίσματα (MeOH:H2O 5:1) όλων των ειδών μέσω LC-MS και ταυτοποιήθηκαν συνολικά πενήντα δύο συστατικά, ενώ μέσω GC-MS μελετήθηκαν τα πτητικά συστατικά των ευρείας εξάπλωσης ειδών, C. foetida και C. rubra, και ταυτοποιήθηκαν τριάντα εννέα συστατικά.Cy-hex:Et2O:MeΟH 1:1:1, πτητικά εκχυλίσματα και ουσίες:•Από τα πτητικά εκχυλίσματα ερευνήσαμε το πλούσιο σε σαλικυλική αλδεΰδη εκχύλισμα CFA (υδραπόσταξη ανθέων της C. foetida) για την αντιφλεγμονώδη δράση του μέσω της αναστολής της έκφρασης του ICAM-1, που επάγεται από τον TNF-α. Το CFA έδειξε μια ισχυρή μείωση της έκφρασης του ICAM-1 κατά 65-70%, σε όλο το εύρος των ελεγχόμενων συγκεντρώσεων, χωρίς να παρουσιάζει καμία κυτταροτοξική δράση.•Με τη δοκιμασία κυτταροτοξικότητας MTT ερευνήσαμε τα κλάσματα, που προέκυψαν από τα άπολα και τα μέσης πολικότητας εκχυλίσματα των ειδών Crepis auriculifolia, C. commutata, C. foetida, C. incana, C. rubra, C. sibthorpiana και Phitosia crocifolia σε ανθρώπινα αδενοκαρκινικά κύτταρα τραχήλου μήτρας (HeLa). Επελέγησαν τα κλάσματα, που περιέχουν σεσκιτερπενικές λακτόνες. Τα πιο δραστικά κλάσματα εμφάνισαν ΙC50 από 9.4 έως 23.7 µg/mL. Ένα φυτικό εκχύλισμα θεωρείται ότι έχει αποδεκτή ισχυρή in vitro κυτταροτοξική δράση, εάν η τιμή IC50 είναι μικρότερη από 20 μg/mL μετά από επώαση για 48 και 72 ώρες. Κατά συνέπεια, τα υπό μελέτη κλάσματα έχουν ισχυρή κυτταροτοξική δράση έναντι των κυττάρων HeLa και θα μπορούσαν να είναι μια πιθανή πηγή κυτταροτοξικών εξειδικευμένων φυσικών προϊόντων. Αυτό επιβεβαιώθηκε στο 2ο μέρος του πειράματος, όπου έγινε η μελέτη των καθαρών ουσιών γροσεϊμίνη (1), 8 επι-γροσεϊμίνη (2), ταραξινικό οξύ (26), φοιτοσίνη A (13), ταναπραιτενολίδιο (21), 2-οξο-11α-υδροξυ-13-διυδροσανταμαρίνη (24), 2β-υδροξυσανταμαρίνη (17), 8-επι-ισο- αμπερμποΐνη (3) 8-επι-ισολιπιδιόλη (11), ιντεγκριφολίνη (4) και 11β,13-διυδρο-ιντεγκριφολίνη (12). Εξ αυτών, οι ουσίες 4, 26, 1 και 21 εμφάνισαν ισχυρή δράση με τιμές IC50 6.5, 9.5 και 10.4 μΜ, αντίστοιχα.•Αναλύθηκε ο in vitro μεταβολισμός δύο σεσκιτερπενικών λακτονών (παρθενολίδιο και γροσεϊμίνη) χρησιμοποιώντας ανθρώπινα ηπατικά μικροσώματα. Πιο συγκεκριμένα, όσον αφορά το παρθενολίδιο, βρέθηκαν πέντε μεταβολίτες στη φάση Ι και ένα γλυκουρονίδιο στο συνδυασμένο μεταβολισμό των φάσεων Ι και ΙΙ. Για την γροσεϊμίνη, ανιχνεύθηκαν τέσσερις μεταβολίτες στη φάση Ι και δύο γλυκουρονίδια στη φάση II.MeOH:H2O 5:1 εκχυλίσματα:Επιπλέον, εξετάστηκαν τα πολικά εκχυλίσματα (MeOH:H2O 5:1), τα οποία ήταν πιο πιθανό να περιέχουν υδρόφιλες ενώσεις πιο σχετικές με την χρήση τους ως βρώσιμα χόρτα και επίσης δυνητικά ισχυρούς αντιοξειδωτικούς παράγοντες. Έτσι, με μια βιο-κατευθυνόμενη προσέγγιση πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες ελέγχου για την αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη και υπολιπιδαιμική δράση των εκχυλισμάτων, μέσω πειραματικών διαδικασιών in vitro (Radical Scavenging of DPPH και Total Phenolic Con-tent-Folin Ciocalteu) και in vivo (μείωση οιδήματος ποδιού και υπολιπιδαιμική δράση σε μύες).Αρχικά, η αντιοξειδωτική δράση και ο προσδιορισμός του ολικού φαινολικού φορτίου αξιολογήθηκαν σε εννέα δείγματα, από τα οποία επιλέχθηκε το πιο δραστικό για περαιτέρω κλασμάτωση (C. incana). Τα κλάσματα, που προέκυψαν αξιολογήθηκαν εκ νέου με τις ίδιες μεθόδους, ώστε στο επόμενο βήμα να γίνει in vivo αξιολόγηση των εκχυλισμάτων και των κλασμάτων, σε μοντέλα φλεγμονής και υπερλιπιδαιμίας σε μύες. Μεταξύ των εκχυλισμάτων που δοκιμάστηκαν, η C. incana παρουσίασε in vitro τα υψηλότερα ισοδύναμα γαλλικού οξέος (GAE) (0.0834 mg/mL) και την υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση (IC50 = 0.07 mg/mL), καθώς και την υψηλότερη αντιφλεγμονώδη δράση in vivo με 32% μείωση του οιδήματος. Επιπλέον, στο υπολιπιδαιμικό πρωτόκολλο, το ίδιο εκχύλισμα αύξησε την ολική αντιοξειδωτική ικανότητα (TAC) στο πλάσμα κατά 48.7% και μείωσε τη χοληστερόλη (41.3%), καθώς και τα τριγλυκερίδια (37.2%)