Genetic and molecular characterization of severe forms of teratozoospermia responsible for male infertility

La tératozoospermie est définie par l’organisation mondiale pour la santé (OMS) par la présence dans l’éjaculat de plus de 96% de spermatozoïdes morphologiquement anormaux regroupant un large éventail de phénotypes avec des anomalies affectant, seules ou simultanément, la tête et le flagelle. Mon travail a été centré sur deux phénotypes rares de tératozoospermie : les Anomalies Morphologiques Multiples du Flagelle (MMAF) caractérisées par la présence dans l’éjaculat de spermatozoïdes immobiles avec des flagelles courts, enroulés, absent ou de diamètre irrégulier ; et la Globozoospermie correspondant à la présence de spermatozoïdes à tête rondes dépourvus d’acrosome. Des altérations génétiques ont été associées à ces phénotypes mais la plupart des cas analysés restent non résolus. L’objectif de ma thèse a donc été d’explorer de nouvelles causes monogéniques de ces deux phénotypes à partir de données d’exomes de cohortes de 167 patients MMAF et 28 patients globozoospermiques.Parmi la cohorte de patients MMAF, nous avons tout d’abord identifié deux patients avec des mutations homozygotes tronquantes dans le gène CFAP70, codant pour une protéine décrite comme régulatrice des bras de dynéines externes de l’axonème. Les immunofluorescences (IF) réalisées ont démontré que l’absence de CFAP70 affectait significativement plusieurs structures axonémales du flagelle notamment les bras de dynéines externes et le complexe axonémal CSC (Calmoduline, Radial Spoke associated Complex). Les issues favorables des injections intracytoplasmique (ICSI) réalisées chez ces patients suggèrent que l’altération de ce gène ne réduit pas les chances de réussite de l’ICSI. Secondairement, nous avons pu identifier six patients porteurs de mutations homozygotes dans le gène MAATS1 codant pour la protéine CFAP91 qui compose le CSC. Les expériences d’IF et de microscopie électronique à transmission ont permis de confirmer l’importance de MAATS1 pour la stabilité du CSC mais aussi d’autres composants de l’axonème. De plus, l’étude du modèle mutant Trypanosome inactivé pour TbCFAP91, l’orthologue de MAATS1, a démontré que l’absence de la protéine induit la perte de la motilité flagellaire couplée à une désorganisation de la paire centrale de l’axonème. L’étude approfondie de notre cohorte MMAF nous a permis par la suite d’identifier une mutation homozygote tronquante dans un nouveau gène, CFAP206. L’étude de différents modèles mutés pour CFAP206 (humains et souris) a montré que la protéine CFAP206 est essentielle pour l’ancrage des ponts radiaires aux microtubules via le CSC. Enfin, nous avons retrouvé des mutations homozygotes délétères dans le gène ZMYND12 chez trois patients. La fonction de ce gène est encore inconnue. Nous avons initié l’étude de ce gène et créé une lignée de souris KO par CRIPSR/Cas9. Les premiers résultats obtenus à partir d’échantillons humains et sur un modèle trypanosome mutant confirment l’implication de ZMYND12 dans la motilité flagellaire et suggère d’éventuelles interactions de cette protéine avec des protéines du CSC et du transport intra-flagellaire. Au final, ces travaux ont permis d’identifier quatre nouveaux gènes impliqués dans le phénotype MMAF et ont démontré la place centrale du complexe CSC dans la stabilité et la fonction du flagelle du spermatozoïde, apportant de nouveaux éléments sur sa fonction et sa composition.Parmi les 28 patients globozoospermiques de notre cohorte, une mutation stop homozygote a été identifié chez un patient sur un nouveau gène candidat FAM205A. La protéine a été localisée par IF dans l’acrosome mature et au niveau de la vésicule acrosomale en formation sur des coupes testiculaires humaines. Grace à la création d’une lignée de rats Fam205a-KO, nous espérons confirmer prochainement l’implication de ce gène dans le phénotype de globozoospermie. Ces données devraient nous permettre à terme d’améliorer nos connaissances sur la physiopathologie de la globozoospermie et sur la biogénèse de l’acrosome.Teratozoospermia is defined by the world health organization (WHO) as the presence in the ejaculate of more than 96% of morphological abnormal spermatozoa, representing a heterogeneous group including a wide range of abnormal sperm phenotypes affecting, solely or simultaneously, the head, or the flagella. My thesis’ work focused on two rare teratozoospermia phenotypes: Multiple Morphological Abnormalities of sperm flagella (MMAF) characterized by the presence in the ejaculate of immotile spermatozoa with severe flagellar abnormalities including short, coiled, absent, and of irregular calibre flagella; and Globozoospermia defined by the presence in the ejaculate of a large majority of round spermatozoa lacking the acrosome. Genetic alterations have already been associated with these phenotypes but many of the studied cases remain unresolved. The objective of my thesis was to explore the monogenic causes of these two phenotypes using exome data from a large cohort of 167 MMAF and 28 globozoospermic subjects.Among the cohort of MMAF patients, we first identified two patients harboring a homozygous truncating mutation in the CFAP70 gene, encoding a protein described as regulating the outer dynein arms of the axoneme. Immunofluorescences (IF) experiments showed that the absence of CFAP70 significantly affected several axonemal structures of the sperm flagellum, in particular outer dynein arms and the axonemal complex CSC (Calmodulin, Radial Spoke associated Complex). Positive outcomes following intra cytoplasmic sperm injection (ICSI) suggested that the alteration of this gene did not compromise the prognosis of ICSI for these patients. Next, we were able to identify six patients with homozygous mutations in MAATS1 coding for CFAP91 which is part of the CSC. IF and transmission electron microscopy experiments confirmed the importance of MAATS1 for the stability of CSC but also of other axonemal components. In addition, the study of Trypanosome mutant model inactivated for TbCFAP91, MAATS1’s ortholog, demonstrated that the absence of the protein induced the loss of flagellar motility coupled with a disorganisation of the central pair of the axoneme. The in-depth study of our MMAF cohort subsequently allowed us to identify a homozygous truncating mutation in a new gene, CFAP206. The study of different models mutated for CFAP206 (human and mouse), showed that the CFAP206 protein is essential for the anchoring of radial spokes to the microtubules through the CSC. Finally, we found homozygous deleterious mutations in ZMYND12 gene in three patients. The function of this gene is still unknown. We have started studying the gene and a knock out (KO) mouse line is being produced for this gene by CRIPSR/Cas9. Our first results, obtained from human samples and a mutant trypanosome model, confirm the involvement of ZMYND12 in flagellar motility and suggest some interactions of this protein with the CSC and with intra-flagellar transport proteins. Overall, this work allowed the identification of four new genes involved in the MMAF phenotype. Overall, our data demonstrate the key role of the CSC complex in the stability and function of the sperm flagellum and provide new insights on its function and composition.Among the 28 globozoospermic patients from our cohort, a homozygous stop mutation was identified in a new candidate gene, FAM205A, in one patient. The protein was localized by IF in the sperm acrosome and in the forming acrosomal vesicle in human testicular sections. With the creation of a Fam205a-KO rat line, we hope, in the very near future, to confirm the involvement of this gene in the globozoospermia phenotype. These data should improve our knowledge on globozoospermia pathophysiology and on acrosome biogenesis