The interaction between the Orai3 calcium channel and the reticular protein STIM2 contributes to prostate cancer cell proliferation and survival

Le calcium intracellulaire (Ca2 +) joue un rôle essentiel en tant que second messager pour réguler la transcription génique, la progression du cycle cellulaire, la prolifération et la mort des cellules. Il est maintenant clair que dans le cancer de la prostate (CaP), la signalisation calcique est altérée favorisant ainsi, la croissance et la progression tumorales. Par conséquent, les canaux calciques sont devenus de nouvelles et potentielles cibles thérapeutiques pour le traitement du CaP. Ces canaux comprennent les canaux de type Orai, impliqués dans les entrées indépendantes ou dépendantes des vidanges calciques réticulaires (Store-Operated Ca2+ Entry ou SOCE) ainsi que leurs régulateurs STIM1 et STIM2 (STromal Interaction Molecules isoformes 1 et 2). Nos travaux récents (données non publiées) ont montré que le canal calcique de type Orai3 et la protéine réticulaire STIM2 sont fortement exprimés dans un modèle de CaP de souris Knock-in (KIMAP), et les expériences d'immunohistochimie effectuées sur des tissus prostatiques tumoraux issus de patients, ont montré des résultats similaires. Nous avons donc étudié si Orai3 et STIM2 peuvent interagir dans les cellules cancéreuses pour induire une entrée calcique qui serait impliquée dans la croissance ou la progression du CaP. In vitro, les expériences de co-immunoprécipitation effectuées sur la lignée cancéreuse prostatique PC-3, ont montré une interaction constitutive entre Orai3 et STIM2 quels que soient les composés utilisés pour induire l'influx de Ca2+. Le test de Proximity Ligation Assay (PLA) a révélé que l'interaction Orai3/STIM2 a lieu au niveau de la membrane plasmique, ou à proximité de celle-ci. Nous avons donc étudié s'il existe une entrée calcique associée à cette interaction, en effectuant des expériences d'imagerie calcique sur des PC-3 n’exprimant pas Orai3 ou STIM2. L’invalidation de STIM2 a diminué l’amplitude de l'entrée calcique basale (constitutive) sans affecter SOCE. D'autre part, la suppression d'Orai3 n'a pas affecté l'entrée basale de Ca2+, mais a considérablement augmenté les niveaux d’influx calcique de type SOCE. Nous avons ensuite analysé les effets de telles fluctuations calciques cytosoliques sur le comportement des cellules cancéreuses. L’invalidation d’Orai3 ou de STIM2 a diminué significativement la migration, la viabilité et la prolifération des PC-3. De manière très intéressante, les cellules cancéreuses n’exprimant pas Orai3, ont présenté un changement morphologique et les expériences de cycle cellulaire ont révélé un blocage de ces cellules en phase G2/M. Cet arrêt s'est accompagné d’une accumulation de la forme inactive de CDK1-Cycline B1, le complexe clé qui régule la transition de la phase G2 à la phase M. Bien que l'invalidation de STIM2 n'ait aucun effet significatif sur la progression du cycle cellulaire, les niveaux transcriptionnels de STIM2 étaient significativement plus élevés dans les cellules synchronisées en G2/M. Ces observations nous ont incités à traiter les PC-3 avec du Docetaxel en l'absence d'Orai3 ou de STIM2 pour étudier son effet sur la viabilité cellulaire. Le traitement au Docétaxel a diminué de façon plus prononcée la viabilité des PC-3 en absence des deux protéines d’intérêt, toutefois, cet effet était plus significatif dans les cellules n’exprimant pas STIM2. L’ensemble de ces résultats révèle un rôle important de cette interaction et de son entrée calcique, dans la prolifération et la survie des cellules CaP. Nous proposons l'hypothèse que l'interaction constitutive Orai3/STIM2 pourrait avoir lieu pour éviter une entrée calcique de type SOCE et l'activation des acteurs SOCE-dépendants, impliqués dans la catastrophe mitotique et la mort cellulaire.Mots clés : cancer de la prostate, signalisation calcique, canaux Orai, STIM2, cycle cellulaire, CDK1-cycline B1, catastrophe mitotique, survie.Intracellular calcium (Ca2+) plays a critical role as a second messenger in gene transcription regulation, cell cycle progression, cell proliferation and death. It is now clear that Ca2+ signaling is altered in prostate cancer (PCa), contributing to tumor growth and progression. Therefore, Ca2+ selective ion channels became prime targets for the development of novel therapeutic approaches for the treatment of PCa. These channels include Orai channels, which are involved in store dependent (Store-operated Ca2+ Entry or SOCE) and independent Ca2+ entries, and their regulators STIM1 and STIM2 (STromal Interaction Molecules isoforms 1 and 2). Our recent work (unpublished data) has shown that Orai3 and STIM2 are highly expressed in a Knock-in PCa mouse model (KIMAP), and immunohistochemistry experiments performed on human PCa tissues yielded similar results. We therefore investigated if Orai3 and STIM2 interact in PCa cells, therefore possibly contributing to Ca2+ entry, and tumor growth or progression. In vitro, co-immunoprecipitation experiments in PC-3 cancer cells demonstrated a constitutive interaction between Orai3 and STIM2 regardless of the compounds used to induce Ca2+ influx. Proximity ligation assay revealed that the Orai3/STIM2 interaction occurs at the plasma membrane, or in close proximity to it. We therefore investigated whether there is a possible related Ca2+ entry by performing Ca2+ imaging experiments on PC-3 cells that have their Orai3 or STIM2 protein expressions silenced. STIM2 knock-down decreased the basal (constitutive) Ca2+ entry levels without affecting SOCE. On the other hand, Orai3 knock-down did not affect the basal Ca2+ entry, but significantly increased SOCE levels. We then analyzed the effects of such changes in cytosolic Ca2+ on PC-3 cell behavior. Both protein invalidations caused a decrease in PC-3 cell migration, viability and proliferation. Very interestingly, Orai3 knock-down cancer cells exhibited morphological changes, and cell cycle experiments revealed their arrest at the G2/M phase. This arrest was accompanied by the accumulation of the CDK1-Cyclin B1 complex, the key complex that regulates the transition from the G2 to the M phase. While STIM2 invalidation had no significant effect on cell cycle progression, the transcriptional levels of STIM2 were significantly higher in G2/M synchronized cells. These observations prompted us to treat PC-3 cells with Docetaxel in the absence of Orai3 or STIM2 to investigate its effect on cell death. Docetaxel led to a stronger decrease in cell viability, an effect that was more pronounced in STIM2 knock-down cells. Together, our findings reveal an important role of Orai3/STIM2 interaction and its related Ca2+ entry in PCa cell survival. We propose the hypothesis that the constitutively active Orai3/STIM2 interaction may occur in cancer cells in order to prevent SOCE, hence avoiding activation of SOCE-dependent players that induce a mitotic catastrophe and death.Keywords: Prostate cancer, Ca2+ signaling, Orai channels, STIM2, Cell Cycle, CDK1-cyclinB1, mitotic catastrophe, survival