Molecular characterization of the RNA-binding domain of influenza A virus Non structural protein 1 (NS1) during RBD/RNA complex formation with high affinity double-stranded RNA arboring in vitro selected sequences

Les virus influenza A (IVA) sont un problème persistant au niveau mondial et notre arsenal thérapeutique actuel n’est pas à l’abri de résistances. La protéine non-structurale 1 (NS1) des IVA limite la réponse antivirale en ciblant majoritairement la réponse interféron (IFN). Réputée pour ses interactions avec de nombreuses protéines cellulaires (Han et al., 2019), NS1 interagit aussi avec des ARN double-brin (dsRNA) et des ARN viraux arborant des motifs conservés du virus (Marc et al., 2013). La double-substitution R38A-K41A, qui invalide son domaine de liaison à l’ARN (RBD), est connue pour abolir la virulence et réduire fortement la multiplication virale, soulignant l’importance du RBD dans les fonctions de NS1 (Trapp et al., 2018) et justifiant le besoin de développer de nouveaux antiviraux ciblant l’interface RBD/dsRNA (Engel, 2013).Marc et al. (2013) ont identifié par SELEX des aptamères d’ARN de haute affinité pour NS1 qui arborent des séquences virales (les motifs AGCAAAAG et UGAUUGAAG) et une séquence canonique de site donneur d’épissage des ARNm cellulaires (le motif double-brin GUAAC). Au cours de ce projet, j’ai montré en mutant spécifiquement dans le segment NS la séquence virale UGAUUGAAG qui est hautement conservée dans la 3’-UTR des ARNm de NS1 que cette séquence n’était pas essentielle au bon déroulement du cycle viral à la différence de la séquence virale AGCAAAAG qui assure un rôle fonctionnel en tant que promoteur de la polymérase virale (de la Luna et al., 1995 ; Marión et al., 1997). En caractérisant par gel retard les éléments de l’ARN et du RBD de NS1 qui sont essentiels à la formation de complexes RBD/dsRNA de haute affinité, j’ai montré que de tels complexes peuvent être observés lorsque le dsRNA (i) fait un minimum de 15 paires de bases et (ii) contient au moins un motif double-brin GUAAC en position distale de la structure tige-boucle. J’ai également mis en évidence une coopération du motif viral AGCAAAAG dans l’interaction du dsRNA avec le RBD de NS1 (Wacquiez et al., en révision). Cette caractérisation nous a permis de concevoir la sonde ARN AWFC01 qui forme des complexes de haute affinité avec le RBD de toutes les NS1 testées. AWFC01 est également 100 fois plus affin pour le RBD de NS1 que ne l’est le dsRNA CHENG utilisé pour résoudre la première structure cristallographie du complexe RBD/dsRNA (Cheng et al., 2009).L’approche structurale que nous avons menée par cristallographie sur AWFC01 indique l’importance des acides aminés contenus dans les hélices 2 et 2’, en particulier R38, dans l’interaction avec les ions phosphates et la fonction 2’OH des riboses de l’ARN, témoignant ainsi d’une reconnaissance spécifique de l’ARN par le RBD de NS1. De façon remarquable, le RBD de NS1, qui ne reconnaît directement ni les nucléobases de l’ARN ni celles des motifs double-brin GUAAC dans AWFC01, induit une légère courbure de AWFC01 (Wacquiez et al., en révision) sans grande modification des paramètres hélicoïdaux de l’ARN. Nos résultats semblent indiquer que le RBD de NS1 se comporte comme le facteur TFIIIA de Xenopus laevis, la protéine B2 du virus Flock House, la protéine NS3 du virus du riz à feuilles blanches ou encore la protéine VP35 du virus Ebola, qui interagissent avec le squelette ribose-phosphate de l’ARN sans en reconnaître les bases spécifiquement. Mots-clés : virus influenza A ; protéine non-structurale 1 ; Domaine de liaison à l’ARN ; Domaine effecteur ; ARN double-brin ; SELEX ; séquence virale AGCAAAAG ; séquence virale UGAUUGAAG ; motif double-brin GUAAC ; ARN AWFC01 ; ARN CHENG ; Cristallographie à rayons X ; courbure de l’ARN.Influenza A virus (IAV) are a global public health problem and our therapeutic issues could be vulnerable to viral resistance. Non-structural protein 1 (NS1) of IAV blocks antiviral responses by inhibiting interferon (IFN) synthesis. Known to interact with several cellular proteins (Han et al., 2019), NS1 also interacts with double-stranded RNA (dsRNA) and viral RNA which arboring virus-specific motif (Marc et al., 2013). R38A-K41A’s double-substitution, which invalides his RNA-Binding Domain (RBD), is known to abolish viral life cycle, indicating essential role of RBD in NS1’s functions (Trapp et al., 2018) and demonstrating importance to develop new anti-influenza compounds which targeting RBD/dsRNA interface (Engel, 2013).Marc et al. (2013) have identified high affinity’s RNA aptamers to NS1 which contains virus-specific motif in their sequence (viral motifs: AGCAAAAG and UGAUUGAAG) and canonical donor splice sites of cellular pre-mRNA (double-strand GUAAC motif). During this PhD, I’ve shown by mutating the UGAUUGAAG viral sequence which is highly conserved in NS genomic segment, that this viral sequence isn’t required in viral life cycle whereas the AGCAAAAG viral sequence, which is known to be viral polymerase promoter, is essential for viral life cycle (de la Luna et al., Marión et al., 1997). Characterization by gel shift assay of required elements in RNA and in protein to form high affinity complexes, I’ve shown that these complexes required a minimum of 15 base pairs dsRNA with one approachable double-stranded GUAAC motif in their sequence. I also demonstrated that the AGCAAAAG viral sequence participate of RBD/dsRNA complex formation (Wacquiez et al., reviewing). These results enable us to conceive the AWFC01’s dsRNA which forms high affinity complex with all tested NS1 proteins. AWFC01 is a 100-fold better affinity for NS1’s RBD than CHENG’s dsRNA used to resolved the first crystallographic RBD/dsRNA complex structure (Cheng et al., 2009).Our structural approach by X-Ray Crystallography with AWFC01 demonstrates that amino acids of 2 and 2’ helical propellers like R38 interact with phosphates and the 2’OH ribose’s function of RNA’s basis, which corresponds to a specific recognition of RNA by the RBD of NS1. Against all odds and whereas our interaction assays by gel shift could indicate a specific recognition of the double-stranded GUAAC’s motif, structural analysis of RBD/RNA complexes demonstrates RNA basis’s specific recognition lacking. Without recognize the RNA basis, the RBD of NS1 induced a small curvature of AWFC01’s dsRNA without big changes in helical parameters in dsRNA (Wacquiez et al., reviewing). Overall, the RBD of NS1 of influenza A viruses seems to be behaving like some other double-stranded RNA binding proteins (dsRBP), in particular the TFIIIA protein of Xenopus laevis, B2 protein of virus flock house, NS3 protein of Hoja Blanca’s virus or VP35 protein of Ebola virus which interact with the ribose-phosphate skeleton without recognize directly basis of dsRNA.Key-words: influenza A viruses; non-structural protein 1; RNA binding domain; Effector domain; double-stranded RNA; SELEX; AGCAAAAG’s viral sequence; UGAUUGAAG’s viral sequence; GUAAC’s double-stranded motif; AWFC01 dsRNA; CHENG dsRNA; X-ray crystallography; RNA curvature