The molecular pathogenesis of GIP-dependent adrenal hyperplasia and invasive pituitary adenomas

Partie I – L’HBMS GIP-dépendante est secondaire à l’expression illégitime du récepteur du GIP (GIPR) dans les lésions surrénaliennes. La nature bilatérale de cette pathologie suggère une prédisposition génétique. Notre objectif était d’identifier le mécanisme moléculaire à l’origine de l’expression ectopique surrénalienne du GIPR. Pour cela, nous avons mené une étude de cohorte et nous avons séquencé l’ADN germinal et somatique issu de surrénalectomie de 17 patients ayant une forme familiale ou sporadique d’HBMS GIP-dépendante. Nous avons réalisé des analyses transcriptomiques dans les échantillons surrénaliens et des analyses fonctionnelles in vitro afin de caractériser les anomalies génétiques identifiées dans des cellules corticosurrénaliennes humaines. Nous avons identifié des variants germinaux pathogènes du gène codant la lysine déméthylase 1A (KDM1A) chez les 17 patients étudiés et nous avons retrouvé une perte de bras court du chromosome 1 porteur du gène KDM1A dans les lésions surrénaliennes entrainant ainsi la perte complète de l’expression surrénalienne de KDM1A. L’étude par RNA-seq a permis d’identifier une régulation différentielle des récepteurs couplés aux protéines G chez les patients porteurs d’un variant de KDM1A parmi lesquels GIPR était le plus surexprimé. L’inhibition pharmacologique in vitro et le knock-out de KDM1A par l’approche CRISPR-Cas9 dans des cellules corticosurrénaliennes humaines entraînaient une augmentation significative de l’expression du GIPR. Nous avons pu montrer que l’HBMS avec expression illégitime du GIPR est une maladie génétique liée à une inactivation en deux étapes de KDM1A selon un modèle de gène suppresseur de tumeur. Partie II : L’envahissement des structures adjacentes, notamment des sinus caverneux par les adénomes hypophysaires limite le résultat du traitement chirurgical. Notre objectif était d’identifier les acteurs moléculaires responsables de l’invasion du sinus caverneux par les adénomes hypophysaires. Pour cela, nous avons comparé par RNA-seq les profils d’expression génique des portions non-invasives et des portions envahissant le sinus caverneux de 19 adénomes hypophysaires, et identifié une surexpression de la DPP4 (Dipeptidylpeptidase 4) dans les parties invasives. Nous avons étudié le rôle de l’inhibition pharmacologique de la DPP4 par la sitagliptine dans la migration et dans l'invasion de cellules hypophysaires murines in vitro. Nous avons mis au point un modèle d’adénomes hypophysaires invasifs murins par injection stéréotaxique orthotopique de cellules hypophysaires GC dans l’hypophyse de rats Wistar Furth. Après l’injection, les animaux étaient monitorés de manière hebdomadaire et le développement tumoral évalué toutes les deux semaines par imagerie par résonance magnétique 7Tesla. La moitié des animaux ont été traités par sitagliptine. L’inhibition de la DPP4 endogène par la sitagliptine diminuait l’invasion et la migration cellulaire in vitro dans deux lignées cellulaires hypophysaires murines. Nous avons également montré que les injections stéréotaxiques intra-hypophysaires conduisaient au développement de tumeurs en 7 semaines. L’étude du volume tumoral nous a permis d’identifier une diminution de la croissance tumorale et une amélioration de la survie dans un sous-groupe d’animaux traités par sitagliptine. Nous avons décrit la signature moléculaire des adénomes hypophysaires invasifs et montré une surexpression de la DPP4, dont nous avons prouvé le rôle dans la migration et l’invasion cellulaire in vitro. La sitagliptine in vivo permettait également de diminuer la croissance tumorale et d’améliorer la survie des animaux. Un plus grand nombre d’animaux seront nécessaires pour confirmer cette observation.Part I: GIP-dependent PBMAH is caused by ectopic expression of GIP receptor (GIPR) in the adrenal tissue. The bilateral nature of this adrenal disease suggests germline genetic predisposition. We aimed to identify the molecular driver event responsible for ectopic GIPR expression in PBMAH. We conducted a cohort study to study germline and somatic DNA from patients who had undergone adrenalectomy for familial or sporadic GIP-dependent PBMAH with Cushing’s syndrome. RNA-sequencing on adrenal samples was performed to study gene expression in GIP-dependent Cushing’s syndrome and in control samples. Functional in vitro studies were performed to study the impact of the genetic event identified in human adrenocortical cells.We identified germline heterozygous pathogenic or likely pathogenic variants in the lysine demethylase 1A (KDM1A) gene in all 17 studied patients. We further identified a recurrent deletion of the short arm of chromosome 1 harboring the KDM1A locus in the adrenal lesions of affected patients. Transcriptome analysis of adrenals from affected patients with loss of KDM1A identified differentially regulated genes, including those encoding for GIPR and some other G protein-coupled receptors. In vitro pharmacologic inhibition, silencing and knock-out by CRISPR-Cas9 genome editing of KDM1A led to an increase in GIPR transcripts and protein in human adrenocortical cells. We found that familial and sporadic GIP-dependent PBMAH is a genetic disease caused in 100% of cases studied by germline inactivating pathogenic variants of the KDM1A with a loss of heterozygosity of the second KDM1A locus in the adrenal lesions. This stepwise inactivation of KDM1A is suggestive of a tumor suppressor gene model of tumorigenesis. Part II: Surgical treatment of pituitary adenomas is frequently incomplete because of invasion of extrasellar cerebral structures, notably, the cavernous sinus. Our aim was to identify the molecular mechanisms of the invasion of cavernous sinus by pituitary adenomas. We obtained a unique tissue collection of 19 invasive pituitary adenomas with a sample from the intrasellar portion and a sample from the portion invading the cavernous sinus for each adenoma. We used RNA-sequencing to compare the gene expression patterns of the invading and intrasellar portions and identified an overexpression of Dipeptidyl-peptidase 4 (DPP4) in the invasive part of pituitary adenomas. We studied the consequences of DPP4 inhibition by sitagliptine on migration and invasion of murine pituitary cell lines using in vitro Transwell Assay. We elaborated a model of invasive pituitary adenomas by stereotactic injection of murine somatotroph GC cell into the lobes of the pituitary gland of female Wistar Furth rats. After surgery, rats were monitored weekly, tumor development was assessed fortnightly by 3 successive 7Tesla MRI (magnetic resonance imaging) and half of the animals were treated by sitagliptine. In vitro pharmacological inhibition of DPP4 decreased cell migration and invasion in GH3 cells and LbT2 cell. Animals injected with GC cells developed invasive pituitary tumors in 7 weeks. Pharmacological inhibition by sitagliptine tended to slow tumor growth and decreased cumulative mortality. We described the molecular signature associated with the invasion of cavernous sinus by pituitary adenomas and identified over expression of DPP4 in invasive part of pituirary adenomas, which was related to pituitary cells migration and invasion in functional in vitro studies. Sitagliptine in vivo tended to decrease tumor growth and mortality from intracranial hypertension, however larger numbers of animals are necessary to confirm this observation