Role of metabolism in the regulation of cardiac contraction excitation coupling : multi-species and multi-regions approaches.

Une première partie de la thèse a permis la mise en place d’un protocole d’isolement de cardiomyocytes provenant de l’oreillette gauche de brebis. Une régionalisation de ces cardiomyocytes au sein de l’oreillette gauche a démontré des hétérogénéités dans les propriétés calciques et le réseau de tubule-t, notamment avec les cardiomyocytes provenant des veines pulmonaires.En seconde partie, l’impact du métabolisme au niveau cardiaque a été évalué sur un modèle de rongeur (rat). La voie de biosynthèse des hexosamines (HBP) aboutit à la formation d’UDP-GlcNAc, qui est le substrat d’une modification protéique post-traductionnelle appelée O-GlcNAcylation. La perturbation de cette voie a été observée dans diverses physiopathologies cardiaques telles que la cardiomyopathie diabétique, l’insuffisance ou l’hypertrophie cardiaque. Cependant, les mécanismes sous-jacents, notamment au niveau de l’activité électrique cardiaque, restent encore à éclaircir.Durant cette thèse, le rôle de la HBP dans l’électrophysiologie cardiaque a été étudié par une approche pharmacologique. L’augmentation des niveaux d’O-GlcNAcylation par la glucosamine est associée avec le déclenchement d’évènements arythmiques sur des cœurs de rats perfusés ex vivo. L’étude électrophysiologique des mécanismes induits par la glucosamine sur les cardiomyocytes ventriculaires isolés a montré une réduction de la durée du potentiel d’action cardiaque, avec une augmentation du courant sortant potassique de fond (Isus). De plus, l’augmentation des niveaux d’O-GlcNAcylation, induite par la glucosamine et le thiamet-G, est associée avec une élévation de la [Ca2+]i diastolique, suggérant une perturbation de l’homéostasie calcique.Dans le compartiment atrial, la HBP semble aussi impliquée dans la régulation de l’activité électrique. En effet, une augmentation des niveaux d’O-GlcNAcylation a été observée dans un modèle de fibrillation atriale chez la brebis. L’expression des enzymes clés responsables de la HBP (GFAT, OGT et OGA) reste inchangée, suggérant une perturbation de leur activité enzymatique, dans ce modèle. Les études fonctionnelles pour la compréhension des mécanismes impliqués lors de l’augmentation des niveaux d’O-GlcNAcylation au niveau atrial ont débuté chez le rat. Plusieurs approches, via différents substrats de la HBP (glucosamine ou hyperglycémie) ou activateur de l’O-GlcNAcylation (thiamet-G), ont été réalisées pour moduler les niveaux d’O-GlcNAcylation. L’hyperglycémie diabétique est corrélée de manière importante avec l’apparition de la fibrillation atriale en clinique. Ainsi, un mécanisme commun impliquant l’O-GlcNAcylation a été envisagé. Dans nos conditions, la perfusion des différentes substances pharmacologiques sur des tissus atriaux de rats ne montrent pas d’effets sur les niveaux totaux d’O-GlcNAcylation et sur l’électrophysiologie atriale. Cependant, ces mêmes substances sur les cardiomyocytes atriaux isolés ont montré une augmentation de la [Ca2+] intracellulaire et une augmentation de relargages calciques spontanés en présence de glucosamine et durant l’hyperglycémie, suggérant une perturbation importante de l’homéostasie calcique. Ces données indiquent qu’une approche sur cardiomyocytes atriaux isolés est nécessaire pour l’étude du rôle de la HBP sur l’électrophysiologie cardiaque.L’ensemble de ces travaux montre une implication de la HBP dans la régulation de l’électrophysiologie et de l’homéostasie calcique cardiaque. En outre, la perturbation de cette voie semble impliquée dans la fibrillation atriale.A first part of the thesis allowed the establishment of a protocol for cardiomyocytes isolation from the left atrium sheep. Regionalization of theses cardiomyocytes within the left atrium demonstrated heterogeneities in calcium handling and t-tubule network, especially with cardiomyocytes from pulmonary veins.In the second part, the impact of metabolism at the cardiac level was carried out on a rodent model (rat). The hexosamine biosynthetic pathway (HBP) leads to UDP-GlcNAc formation, which is the substrate for a post-translational modification called O-GlcNAcylation. HBP disruption is involved in several cardiac physiopathological induced by diabetes, heart failure or cardiac hypertrophy. However, the underlying mechanisms, particularly in cardiac electrical activity, remain poorly elucidated.During this thesis, the role of HBP in cardiac electrophysiology was studied with a pharmacological approach. O-GlcNAcylation levels increasing by glucosamine is associated with the initiation of arrhythmic events in ex vivo perfused rat hearts. Electrophysiological study of mechanisms induced by glucosamine on isolated ventricular cardiomyocytes showed a shortening of action potential duration, with an increasing of the background outward potassium current (Isus). Furthermore, the O-GlcNAcylation levels increasing, induced by glucosamine or thiamet-G, is associated with elevated diastolic intracellular calcium concentration, suggesting a disturbance in calcium handling.In the atrial location, HBP also appears to be involved in the regulation of electrical activity. Indeed, O-GlcNAcylation levels increasing was observed in sheep model of atrial fibrillation. The expression of key enzymes responsible for HBP activity (GFAT, OGT and OGA) remained unchanged, suggesting a disruption of their enzymatic activity, in this model. Functional studies in order to understand mechanisms involved during high levels of O-GlcNAcylation in atria have begun in rats. Several approaches with different substrates (glucosamine or hyperglycaemia) or activator (thiamet-G) of the HBP have been performed to modulate O-GlcNAcylation levels. Diabetic hyperglycaemia is significantly correlated with the atrial fibrillation occurring in clinic, so a common underlying mechanism involving O-GlcNAcylation has been considered. Data collected, under our conditions, on perfused rat atrial tissues have shown no effects of different approaches used on total O-GlcNAcylations levels and atrial electrophysiology. However, these approaches on isolated atrial cardiomyocytes have shown an increasing of diastolic intracellular calcium concentration and spontaneous calcium released during glucosamine and hyperglycaemia, suggesting a significant disturbance of calcium handling. These data suggest than isolated atrial cardiomyocytes, instead of atrial tissue, is required to study the role of HBP on electrophysiology.Together, these results shows an involvement of HBP in the regulation of cardiac electrophysiology and calcium handling. Moreover, the disruption of this pathway seems to be involved during atrial fibrillation