Hétérogénéité du rétinoblastome : une analyse multi-omique et transcriptomique de cellules uniques

Le rétinoblastome est un cancer pédiatrique dérivé de la rétine. Bien que rare, c'est la tumeur maligne intraoculaire la plus fréquente chez l'enfant. Le rétinoblastome est traité par une thérapie locale aux premiers stades, mais aux stades ultérieurs, il nécessite une chirurgie d'énucléation et une chimiothérapie systémique. Sans un diagnostic en temps utile et un traitement approprié, des métastases peuvent se développer et entraîner des maladies mortelles.Le rétinoblastome est une maladie hétérogène. Les cellules tumorales de différents patients ou différentes cellules d'un même patient peuvent présenter des caractéristiques moléculaires et phénotypiques distinctes. D'un point de vue histopathologique, les cellules tumorales peuvent présenter une différenciation à divers niveaux, ainsi qu'une croissance exophytique, endophytique ou mixte. En ce qui concerne la génomique, le rétinoblastome survient principalement après une inactivation bi-allélique de RB1 et, dans de rares cas, une amplification de MYCN peut également déclencher la maladie. En termes de transcriptomique, quelques études ont été réalisées et ont révélé que le rétinoblastome peut présenter des degrés variés dans les signatures de différenciation des photorécepteurs.Dans notre travail, nous avons identifié deux sous-types moléculaires basés sur l'analyse de 102 rétinoblastomes en utilisant le séquençage de l'exome entier, le SNP array, la puce à l'expression des gènes et la puce à la methylation d'ADN. Nous avons réalisé le clustering en utilisant une stratégie combinant le clustering hiérarchique consensuel et le clustering basé sur les centroïdes. Nous avons démontré que les tumeurs de sous-type 1 présentaient une signature plus mature de différenciation du photorécepteurs cône et se manifestaient généralement chez les enfants de moins de 18 mois, tandis qu'un niveau plus faible de différenciation du photorécepteurs cône est corrélé à un niveau élevé de caractéristiques ganglionnaires/neuronales, de signatures de souches et d'instabilité génomique dans les tumeurs de sous-type 2, que l'on retrouve davantage chez les enfants de plus de 18 mois. L'analyse d'une série indépendante de 112 rétinoblastomes présentant des facteurs pathologiques à haut risque a révélé que les tumeurs qui métastasent expriment toutes la protéine TFF1, le gène qui est le plus exprimé à la hausse dans les tumeurs de sous-type 2 par rapport aux tumeurs de sous-type 1. Nous avons analysé 14 rétinoblastomes en utilisant le séquençage de l'ARN unicellulaire, et avons confirmé cette hétérogénéité inter-tumorale. L'une des tumeurs analysées présentait une hétérogénéité intra-tumorale au niveau phénotypique et génomique : certaines cellules tumorales présentaient un degré plus élevé de différenciation des cônes et la perte de différenciation des cônes s'accompagnait d'une accumulation d'altérations génomiques, tandis que d'autres cellules présentaient des altérations génomiques et des phénotypes totalement différents. Nous avons décrit le paysage immunitaire du rétinoblastome par le transcriptome unicellulaire, et avons découvert que différents types de cellules immunitaires sont présents dans le microenvironnement tumoral, notamment de multiples populations de cellules de la lignée monocytaire telles que les macrophages M2 protumoraux alternatifs et les cellules présentatrices d'antigènes, de multiples populations de cellules T telles que les cellules T régulatrices CD4+ et les cellules T cytotoxiques CD8+, ainsi que les cellules NK. L'infiltration des macrophages M2 a été validée par immunohistochimie et a été associée à un niveau élevé d'expression du MIF par une analyse de la puce à cytokines et d'une prédiction in silico de ligand-récepteur de cellule unique.En conclusion, notre analyse multi-omique et transcriptomique de cellule unique a permis de caractériser de manière complet l'hétérogénéité inter- et intra-tumorale et de décrire le paysage immunitaire du rétinoblastome.Retinoblastoma is a pediatric cancer derived from the retina. The global annual incidence is around 8000 new cases. Although rare, it is the most common intraocular malignancy in children. Retinoblastoma is treated with local therapy at early stages, but at later stages, it requires enucleation surgery and systemic chemotherapy. Without timely diagnosis and proper treatment, metastasis can develop and lead to lethal diseases.Retinoblastoma is a heterogeneous disease. Tumor cells in different patients or different cells in one patient can exhibit distinct molecular and phenotypic characteristics. From the histopathological perspective, tumor cells can present differentiation at diverse levels, and exhibit exophytic, endophytic or mixed growth. With regard to genomics, retinoblastoma arises predominantly after bi-allelic RB1 inactivation and in rare cases, MYCN amplification may also initiate the disease. Other mutations and genomic alterations may also contribute to the progression of the retinoblastoma such as BCOR mutations, chromosome 1q gain, 6p gain, or 16q loss. In terms of transcriptomics, a few studies were performed and revealed that retinoblastoma can display varied degrees in photoreceptor differentiation signatures.In our work, we identified two molecular subtypes based on the analyses of a series of 102 retinoblastoma using whole-exome sequencing, SNP array, gene expression microarray and DNA methylation array. We made the clustering using a strategy combining consensus hierarchical clustering and centroid based clustering. We demonstrated that subtype 1 tumors exhibited a more matured cone differentiation signature and were usually manifested in children less than 18 months, while lower level of cone differentiation correlate with elevated level of ganglion/neuronal features, stemness signatures, and genomic instability in the subtype 2 tumors that were found more in children more than 18 months. Analysis of an independent series of 112 retinoblastomas with high risk pathological factors uncovered that tumors that metastasize all expressed TFF1 protein, the gene that is most upregulated in subtype 2 tumors as compared to subtype 1 tumors. We analyzed 14 retinoblastomas using single-cell RNA sequencing, and confirmed this inter-tumoral heterogeneity. One of the tumor analyzed displayed intra-tumoral heterogeneity at both phenotypic and genomic level, that some tumor cells exhibited higher grade of cone differentiation and loss of cone differentiation was accompanied with accumulation of genomic alterations, while other cells presented entirely different genomic alterations and phenotypes. We depicted the immune landscape of retinoblastoma through single-cell transcriptome, and uncovered that various immune cells types are presented in tumor microenvironment, including multiple populations of monocytic lineage cells such as the protumoral alternative M2 macrophages and antigen presenting cells, multiple populations of T cells such as CD4+ regulatory T cells and CD8+ cytotoxic T cells, as well as NK cells. The infiltration of M2 macrophages was validated by immunohistochemistry, and was found associated with high-level of MIF expression through cytokine array and in-silico single-cell ligand-receptor prediction.Taken together, our multi-omic and single-cell transcriptomic analysis comprehensively characterized the inter- and intra- tumoral heterogeneity and portraited the immune landscape in retinoblastoma