Functional exploration of skin cells in response to glyoxal and identification of factors involved in diabetes-related delayed wound healing : testing Metformin as an anti-glycaemic molecule

Les personnes diabétiques présentent un risque accru de développer des plaies chroniques, le plus souvent au niveau du pied, pouvant mener jusqu’à l’amputation. Les causes de ce défaut de cicatrisation sont encore mal connues. Il a cependant été montré qu’une des conséquences de l’hyperglycémie est l’accumulation de produits terminaux de glycation, ou AGEs, tel que le Nε-(carboxymethyl)lysine (CML), au niveau de la peau des patients. Notre projet a eu pour objectif de mettre en évidence les effets de la glycation au niveau cutané afin de mieux comprendre les défauts de cicatrisation des diabétiques. Dans un premier temps, notre travail a consisté à étudier le comportement des fibroblastes dermiques humains en réponse à un agent de glycation fort : le glyoxal. Nous avons montré une diminution importante de la prolifération et de la migration cellulaire à la suite d’une accumulation de CML. Il apparaît qu’en présence de glyoxal les fibroblastes produisent correctement le collagène I mais sont incapables de le cliver et/ou de l’assembler correctement. Ces résultats suggèrent que la glycation pourrait retarder la fermeture d’une plaie et induire une fragilité cutanée. Nous avons également pu mettre en évidence une forte accumulation de vésicules lipidiques dans le cytoplasme des fibroblastes en réponse au glyoxal, ce qui traduit un déséquilibre important du métabolisme des lipides comme il est observé chez les diabétiques. Pour aller plus loin, la metformine aux propriétés antiglycantes, pourrait permettre de limiter l’accumulation lipidique. Par la suite, un modèle de peaux 3D avec kératinocytes, fibroblastes et cellules endothéliales a été testé en présence de glyoxal et/ou de metformine. Le glyoxal induit une diminution de la maturité des vaisseaux sanguins, une forte perturbation de la différenciation épidermique avec notamment une diminution de l’épaisseur de l’épiderme et de l’expression de la kératine 1. Dans un modèle 3D de cicatrisation, nous avons montré que la migration des kératinocytes est drastiquement diminuée après traitement au glyoxal. Ces modèles 3D nous ont permis de mettre en évidence que la metformine est capable de rétablir partiellement la différenciation épidermique et d’améliorer la stabilité des vaisseaux sanguins, mais ne permet pas d’augmenter la migration des kératinocytes. Enfin, nous avons testé un pansement contenant de la metformine sur des plaies de compression chroniques induites chez la souris diabétique. Sur ce modèle in vivo nous n’avons cependant pas pu mettre en évidence une amélioration de la cicatrisation en présence de metformine. Ces travaux de thèse ont permis de mettre en évidence que la glycation est à l’origine d’une perturbation forte de différents paramètres essentiels au processus de cicatrisation comme la migration, la prolifération, la différenciation et le remodelage de la matrice extracellulaire. Ces résultats ouvrent d'importantes perspectives pour étudier les complications cutanées liées au diabète et la mise en place d'approches thérapeutiques innovantes comme la metformine qui montre un fort potentiel.The risk of developing chronic wounds such as diabetic foot is prevalent among diabetic patients, leading to amputation. Although causes leading to wound healing defect are still poorly understood, it has been shown that Advanced Glycation End-products (AGEs) like Nε-(carboxymethyl)lysine (CML), resulting from chronic hyperglycemia, are accumulated in the skin. In this work, we aimed to highlight cutaneous glycation effects to better understand the wound healing delay among diabetic patients. First, we studied human dermal fibroblast behavior after the addition of a strong glycating agent: the glyoxal. We validated that the addition of glyoxal triggered an accumulation of CML linked to a drastic decrease in fibroblasts proliferation and migration. It appeared that in presence of glyoxal, type I collagen is correctly produced but it does not mature properly and it cannot induce the formation of collagen fibers. These results evidenced the pronounced effects of glycation on wound healing and skin quality. Moreover, glyoxal induced a strong accumulation of lipid droplets in the cytoplasm of fibroblasts, demonstrating a significant imbalance in lipid metabolism as observed in diabetic patients. To go further, we proved that metformin, as anti-glycating molecule, could prevent lipid droplets accumulation. Next, a 3D skin model with keratinocytes, fibroblasts and endothelial cells was performed with glyoxal and metformin. Interestingly, the presence of glyoxal decreased vessel maturity and disturbed epidermal differentiation with a decrease of epidermal thickness and keratin 1 expression. A 3D wound healing skin model showed a slowdown of keratinocyte migration in response to glyoxal. These 3D models allowed us to highlight that metformin restores epidermal differentiation and ameliorates vessel stability. However it was not related to the restoration of keratinocytes migration. Finally, the application of a metformin-containing dressing on chronic compression wounds performed on diabetic mice was not related to a wound healing improvement in these experimental conditions. Taking together, our results could explain skin fragility found in diabetic patients. Indeed, glyoxal seemed to act at different levels and disturbed some wound healing stages, such as proliferation, migration, neo-epidermis formation and remodeling of extracellular matrix. These encouraging results open broad perspectives for the study of skin diabetic complications and the establishment of innovative therapeutic approaches and particularly, the high potential of metformin