Intermolecular resonance energy transfer from a quenched donor (DRET) : applications to fluorogenic detection of nucleic acids and their visualisation

Les récentes découvertes de l'implication des acides nucléiques dans un large éventail de processus biologiques ont révélé l'importance de pouvoir les détecter et les localiser précisément au sein des cellules. Pour y parvenir, de nombreuses stratégies ont été élaborées. Le processus de transfert d'énergie par résonance entre deux molécules fluorescentes (FRET) a largement contribué à relever ce défi. Cependant, des problèmes liés aux recouvrements spectraux du donneur et de l'accepteur limitent sa sensibilité. Des chercheurs ont récemment découvert la possibilité de réaliser un transfert d'énergie par résonance à partir d'un donneur éteint (Dark-RET : DRET). De nouveaux fluorophores, combinant un donneur éteint et un accepteur fluorescent au sein de la même entité moléculaire, ont été conçus. En détournant ce concept au travers d'une approche intermoléculaire, nous avons développé une nouvelle méthode de détection fluorogénique des acides nucléiques. Celle-ci présente l'avantage de réduire considérablement le bruit de fond de manière très simple. Le fluorène push-pull DFK, qui remplit parfaitement toutes les exigences d'un donneur éteint pour du DRET intermoléculaire, a été synthétisé sous forme d'un amidite. Ce dernier a été incorporé dans de nombreuses sondes d'acide nucléique. L'hybridation de l'une d'entre elles avec sa séquence complémentaire marquée par un accepteur brillant a généré un facteur d'amplification record de 256. Ce résultat a confirmé la capacité du DRET à conférer à un donneur éteint le potentiel de fluorescence de l'accepteur avec lequel il est associé. La preuve de concept a ensuite été réalisée in cellulo pour la détection de la séquence ARNm oskar. Le signal de fluorescence correspondant à sa localisation est alors sorti très nettement du bruit de fond résiduel. Néanmoins, les performances de cette nouvelle méthode de détection des acides nucléiques varient fortement en fonction de la composition nucléotidique des séquences. Afin de la rendre universelle, il est essentiel de se concentrer sur la conception de nouveaux fluorophores, insensibles à cette variation. Le développement de tels outils fluorogéniques permettrait d'éclairer de nombreux processus biologiques sous les feux d'un autre projecteur.Recent discoveries of the involvement of nucleic acids in a wide range of biological processes have highlighted the importance of being able to detect and localise them precisely within cells. To achieve this, many strategies have been developed. The process of resonance energy transfer between two fluorescent molecules (FRET) has made a major contribution to meeting this challenge. However, problems related to spectral overlaps between the donor and acceptor limit its sensitivity. Researchers have recently discovered the possibility of performing resonance energy transfer from a quenched donor (Dark-RET: DRET). New fluorophores, combining a quenched donor and a fluorescent acceptor within the same molecular entity, have been designed. By revisiting this concept through an intermolecular approach, we have developed a new method for fluorogenic detection of nucleic acids. This has the advantage of considerably reducing the background noise in a very simple way. The push-pull fluorophore DFK, which fulfils all the requirements of a quenched donor for intermolecular DRET, has been synthesized as an amidite. The latter has been incorporated into numerous nucleic acid probes. Hybridisation of one of these with its complementary sequence labelled with a bright acceptor generated a record amplification factor of 256. This result confirmed the ability of DRET to confer on a quenched donor, the fluorescence potential of the acceptor with which it is associated. The proof of concept was then performed in cellulo for the detection of the oskar mRNA sequence. The fluorescence signal corresponding to its localisation then emerged very clearly from the residual background. Nevertheless, the performance of this new nucleic acid detection method varies greatly depending on the nucleotide composition of the sequences. In order to make it universal, it is essential to focus on the design of new fluorophores, insensitive to this variation. The development of such fluorogenic tools would allow many biological processes to be illuminated under a different spotlight offering a new angle of examination