Evaluation of toxicity in pesticide amphibians from agricultural areas in the state of Tocantins, Brazil

Os anfíbios constituem a Classe de vertebrados com maior proporção de espécies ameaçadas de extinção (mais de 40%), sendo a perda de habitat e a poluição antropogênica duas das principais causas desta realidade. De todas as fontes de poluição ambiental, os agrotóxicos são de grande preocupação, pois a sua libertação para meio ambiente é enorme e os anfíbios comumente habitam os agroecossistemas onde esses produtos químicos são aplicados. Esse taxon é reconhecido como um bom indicador de saúde ambiental, contribuindo para o funcionamento saudável dos ecossistemas. Os anfíbios são importantes elos em teias tróficas, consumindo várias espécies de invertebrados que são consideradas prejudiciais à agricultura, proporcionando assim o controle biológico de pragas. Mas, seu papel nos ecossistemas vai além, pois eles também podem ser presas; sendo assim de extrema importância para as funções do ecossistema. No entanto, há uma ampla lacuna de conhecimento na literatura científica sobre os possíveis impactos de agrotóxicos, da gestão e da prática agrícola sobre as populações de anfíbios nas regiões tropicais. Especificamente, o Brasil é um dos maiores produtores agrícolas (com 7,64% do seu território cultivado). Com a crescente expansão agrícola, estima-se que em torno de 335 mil toneladas de agrotóxicos tenham sido vendidas em 2019, sendo que esse volume foi 16% maior do que no ano anterior (2018). Neste contexto, objetivou-se nesta tese avaliar os efeitos de diferentes graus de mudanças na paisagem, induzidos pela agricultura, e do uso de pesticidas sobre o estado de saúde de populações naturais de espécies de anuros tropicais. Para isso, foram definidos três objetivos específicos: (i) avaliar a influência da fitofisionomia de paisagem (microambiente agrícola, pastagem e paisagem de Cerrado não alterada), e do uso de pesticidas, na diversidade e condição corporal de populações naturais de anfíbios anuros, (ii) identificar se a exposição a diferentes fitofisionomias de paisagem e a pesticidas altera o nicho isotópico de girinos e adultos de populações naturais de anuros; (iii) identificar os efeitos adversos provocados por quatro formulações comerciais de pesticidas agrícolas em girinos de anfíbios anuros tropicais (Anura: Ranidae). Relativamente ao primeiro objectivo, os resultados obtidos revelaram diferenças nas diversidades e condições corporais nos ambientes antropizados e florestais. Os locais de referência apresentaram maior diversidade de anfíbios, em particular no local de paisagem de transição de Cerrado e Floresta Amazónia e no local de pastagem. No que refere às diferenças observadas na condição corporal de anfíbios adultos oriundos dos diferentes locais, não foi possível estabelecer uma associação com as diferentes fitofisionomias ou uso de pesticidas. No que respeita ao segundo objetivo, entre os três locais de estudo não foram observadas diferenças isotópicas de δ¹⁵N e de δ¹³C. No entanto, independente do ambiente considerado, observouse variação entre os grupos florísticos. Sendo assim, a composição isotópica dos girinos do local Agrícola apresentou relação com os dados de isótopos (δ¹⁵N e de δ¹³C) do sedimento. No entanto, no local Natural essa relação isotópica entre os girinos e o sedimento não foi observada. Os nichos isotópicos dos girinos dos ambientes Natural e de Pastagem apresentam alto grau de sobreposição. Os girinos apresentaram maior amplitude de nicho isotópico no Agrícola, com área média da elipse bayesiana padrão de 20,12 (14,76 – 148,60)‰, completamente distintos do Natural, com 16,04 (9,36 – 115,20) ‰, e o nicho isotópico mais restrito foi em Pastagem de 13,80 (3,38 – 211,60) ‰. A maior abundância de girinos no local Agrícola pode estar associada à presença de espécies generalistas ou com hábitos que acabam por se beneficiar das mudanças do uso do solo, como é o caso da espécie Leptodactylus latrans. Para os anuros adultos os valores médios registrados para δ¹⁵N e de δ¹³C, envolveu 75 adultos dos três locais, sendo a maior abundância e riqueza de espécies observadas para o local Natural (com 42 indivíduos); Agrícola (31 indivíduos) e Pastagem (apenas dois indivíduos). Os géneros analisados foram: Dendropsophus; Elachistocleis; Hypsiboas; Leptodactylus; Lysiaps; Osteocephalus; Physalaemus; Rhinella ; Scinax. No local Natural foi registada a maior diversidade no gênero Leptodactylus (cinco espécies), do que nos outros dois locais (Agrícola e de Pastagem). O gênero mais abundante tanto nos locais Natural quanto no Agrícola foi Leptodactylus. Finalmente, no que respeita ao terceiro objetivo delineado neste trabalho, verificou-se que das quatro formulações de pesticidas testadas a que apresentou maior toxicidade letal para girinos de P. cuvieri, P. azurea, e L. labyrinticus foi o Roundup®. Foi então construída uma curva de distribuição de sensibilidade de espécies para este composto, tendo-se calculado uma concentração de perigo para 5% das espécies de 0,751 mg/L do ingrediente ativo (i.a.) glifosato. Considerando que já foram reportados valores de 0,56 mg/L deste i.a. em águas superficiais, estima-se que o Roundup® possa apresentar algum risco para anfíbios, principalmente para situações de exposição a longo prazo. A sensibilidade das espécies de anuros tropicais posicionou-se a meio da curva de distribuição de sensibilidades. No entanto, não é possível retirar conclusões sobre a sensibilidade relativa destas espécies comparativamente às espécies de anuros de outras regiões geográficas, pois os dados sobre a toxicidade de glifosato para espécies de anuros tropicais são ainda escassos. Mais ainda esta escassez de dados de toxicidade de pesticidas para anuros tropicais observou-se para as outras três formulações estudadas, o que impediu a realização de uma análise semelhante. Estes resultados apontam assim para a necessidade de se gerar mais conhecimento sobre a toxicidade que os agrotóxicos podem causar neste grupo de organismos, uma vez que a diversidade de espécies de anfíbios identificadas nas regiões tropicais é elevada e estão expostas a práticas de agricultura intensiva. O presente trabalho, permitiu concluir que a exposição prolongada de populações naturais a pesticidas e a diferentes fitofisionomias de paisagem contribuem para diminuir a diversidade específica de anuros. Mais ainda a composição isotópica de anuros adultos demonstrou sobreposição entre os locais Natural e Agrícola (devido prática empregada no manejo da cobertura do solo). Registou-se ainda que houve dominância de espécies generalistas de anfíbios nas paisagens estudas. Com base nestes resultados, considera-se necessário desenvolver investigação adicional de modo a perceber a influência de cada um destes fatores (pesticidas e fitofisionomia de paisagem) no decréscimo de diversidade de anuros de forma a promover de forma mais eficaz a conservação dos anfíbios tropicais.Amphibians are among the vertebrates with the highest proportion of species threatened with extinction (more than 40 %), with habitat loss and anthropogenic pollution being the main threatening factors. Of all the sources of environmental pollution, pesticides are of great concern, as their release into the environment is enormous and amphibians commonly inhabit the agroecosystems where these chemicals are applied. This taxon is recognized as a good indicator of environmental health, contributing to the healthy functioning of ecosystems. Amphibians are important links in food webs, consuming several species of invertebrates that are considered harmful to agriculture, thus providing biological pest control. But their role in ecosystems goes further, as they can also be preys; thus, being of extreme importance for ecosystem functions. However, there is a wide knowledge gap in the scientific literature about the possible impacts of pesticides, management, and agricultural practice on amphibian populations in tropical regions. Specifically, Brazil is one of the largest agricultural producers (with 7.64% of its territory cultivated). With the growing agricultural expansion, following the sale of pesticides in the country, it is estimated that around 335,000 tons of plant protection products were sold in year 2019, with this volume being 16% higher than in the previous year (2018). In this context, the present thesis aimed to evaluate the effects of different degrees of changes in agriculture-induced landscape and pesticides use on the health status of natural populations of tropical anuran species. For this, the following three specific objectives were defined: (i) to evaluate the influence of landscape phytophysiognomy (agricultural microenvironment, pasture and unaltered Cerrado landscape), and the use of pesticides, on the diversity and body condition of natural amphibian populations frogs, (ii) identify whether exposure to different landscape physiognomies and pesticides alters the isotopic niche of tadpoles and adults of natural frog populations; (iii) identify the adverse effects caused by four commercial formulations of agricultural pesticides in tropical anuran amphibians tadpoles (Anura: Ranidae). The results obtained revealed differences in diversities and body conditions in anthropic and forest environments. The diversity of amphibian species was higher at the reference sites, namely at the site of transition between Cerrado and Amazonia Forest landscape and at site Pasture. With regard to the differences observed in the body condition of adult amphibians from different locations, it was not possible to establish an association with the different phytophysiognomies or use of pesticides. Among the three study sites, isotopic differentiations of δ¹⁵N e de δ¹³C were not observed. However, regardless of the environment considered, there was variation between the floristic groups. Thus, the isotopic composition of tadpoles from the Agricultural site was related to the isotope data (δ¹⁵N e de δ¹³C) of the sediment. In Natural sites this isotopic relationship between tadpoles and sediment was not observed. The isotopic niches of tadpoles from the Natural and Pasture environments show a high degree of overlap. Tadpoles showed greater isotopic niche amplitude in the Agricola site, with an average area of the standard Bayesian ellipse of 20.12 (14.76 - 148.60) million percent, completely different from Natural, with 16.04 (9.36 - 115.20) ‰, and the most restricted isotopic niche was in Pastagem de 13.80 (3.38 – 211.60) ‰. The greater abundance of tadpoles in the agricultural matrix may be associated with the presence of generalist species or with habits that end up benefiting from changes in land use, as is the case of the species Leptodactylus latrans. For adult frogs, the mean values recorded for δ¹⁵N e de δ¹³C involved 75 adults from the three locations, with the greatest abundance and richness of species observed for the Natural location (with 42 individuals); Agricultural (31 individuals) and Pasture (only two individuals). The analyzed genera were: Dendropsophus; Elachistocleis; Hypsiboas; Leptodactylus; Lysiaps; Osteocephalus; Physalaemus; Rhinella; Scinax. In the Natural environment, greater diversity was recorded in the genus Leptodactylus (five species), than in the other two locations (Agricultural and Pasture). The most abundant group in both Natural and Agricultural was Leptodactylus. Regarding the third objective outlined in this work, it was found that of the four pesticide formulations tested, the one with the highest lethal toxicity for P. cuvieri, P. azurea, and L. labyrinticus tadpoles was Roundup®. A species sensitivity distribution curve for this compound was then constructed, and a hazard concentration for 5% of species of 0.751 mg/L of the active ingredient (a.i.) glyphosate was calculated. Considering that values of 0.56 mg/L of this a.i. have already been reported in surface waters, it is estimated that Roundup® may present some risk to amphibians, especially for long-term exposure scenarios. The sensitivity of tropical anuran species was positioned in the middle of the sensitivity distribution curve. However, it is not possible to draw conclusions about the relative sensitivity of these species compared to anuran species from other geographic regions, as data on the toxicity of glyphosate for tropical anuran species are still scarce. Furthermore, a scarcity of pesticide toxicity data for tropical anurans was observed for the other three formulations studied, which prevented a similar analysis from being carried out. These results point to the need to generate more knowledge about the toxicity that pesticides can cause in this group of organisms, since the diversity of amphibian species identified in tropical regions is high and they are exposed to intensive agricultural practices. The present work allowed us to conclude that the prolonged exposure of natural populations to pesticides and different landscape phytophysiognomies contribute to reduce the species diversity of anurans. Furthermore, the isotopic composition of adult frogs showed an overlap between the Natural and Agricultural locations (due to the practice used in the management of soil cover). It was also observed that there was a predominance of generalist species of amphibians in the studied landscapes. Based on these results, it is considered necessary to develop additional research to understand the influence of each of these factors (pesticides and landscape phytophysiognomy) in the decrease in anuran diversity to promote a more effective conservation of tropical amphibians.Apoio financeiro da Fundação de Apoio à Pesquisa –FAPT, Governo do Estado do Tocantins/ Brasil e do do Instituto Federal do Tocantins – IFTO/ Brasil.Programa Doutoral em Biologia e Ecologia das Alterações Globai