Identification et étude du rôle des protéines cibles du monoxyde d'azote (NO) dans les réponses de défense chez le tabac

Studies conducted over the past ten years indicate that nitric oxide (NO) is a physiological mediator involved in many physiological processes in plants, including germination, root development, stomatal closure or responses against biotic or abiotic stresses. Despite this important range of functions, the mechanisms underlying the effects of NO in plants remain largely unknown. The present work aims at identifying and functionally characterizing NO target proteins in tobacco in the context of biotic and abiotic stresses. We demonstrated that cryptogein, an elicitor of defense responses, induces a rapid and transient S-nitrosylation of several proteins in tobacco cell suspensions. After purification, a dozen of these proteins have been identified through mass spectrometry analysis. These proteins include CDC48 (Cell Division Cycle 48), a chaperone-like protein belonging to the AAA-ATPase family. The regulation of CDC48 by NO was deeply investigated using a combination of structural and biochemical analyses. Once the in vitro S-nitrosylation of CDC48 was confirmed, we next demonstrated that this process does not affect the secondary structure of the protein but induces local changes in its tertiary structure together with an inhibition of its ATPase activity. The cysteine residue 526, located in the second ATPase domain of the protein, was identified as a probable S-nitrosylation site. This crucial localization may explain the inhibitory effect of NO on CDC48 enzymatic activity. The last part of this work was focused on the analysis of the mechanisms underlying the NO-dependent activation of the protein kinase NtOSAK (Nicotiana tabacum stress activated protein kinase) in tobacco. We demonstrated that NtOSAK forms a constitutive complex with glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). In response to salt stress, NO promotes the activation of NtOSAK via the phosphorylation of two serine residues located in the activation loop of the enzyme. Moreover, it induces a rapid S-nitrosylation of GAPDH. Interestingly, this latter process does not affect the complex formation. Our hypothesis is that once S-nitrosylated, GAPDH might act as a phosphorelay recruiting protein substrates for NtOSAK.Les études entreprises depuis une douzaine d'années indiquent que le monoxyde d'azote (NO) est un médiateur physiologique impliqué dans de nombreux processus chez les plantes, incluant la germination, le développement des racines, la fermeture des stomates ou encore la réponse adaptative aux stress biotiques et abiotiques. Malgré cet important panel de fonctions, les mécanismes sous-jacents aux effets du NO ont été peu appréhendés et restent pour l'essentiel énigmatiques. Le travail présenté dans ce manuscrit s'inscrit dans cette problématique et a consisté en l’identification et la caractérisation de protéines cibles du NO chez le tabac dans le contexte de stress biotiques et abiotiques. Nous avons démontré que la cryptogéine, un éliciteur des réactions de défense, induit la S-nitrosylation rapide et transitoire de plusieurs protéines dans des suspensions cellulaires de tabac. Après purification, une douzaine de ces protéines ont été identifiées via une analyse par spectrométrie de masse. Celles-ci incluent notamment une protéine chaperonne de la famille des AAA-ATPase nommée CDC48 (Cell Division Cycle 48). Cette dernière a fait l'objet d'une étude structure/fonction approfondie afin d'appréhender l'impact de sa S-nitrosylation. Après avoir vérifié que la protéine recombinante était S-nitrosylable in vitro, nous avons démontré que ce processus n'affecte pas la structure secondaire de la protéine mais induit des modifications locales de sa structure tertiaire et une inhibition de son activité ATPasique. Le résidu cystéine 526, localisé dans le second domaine ATPasique de la protéine, a été identifié comme site probable de S-nitrosylation. Cette localisation stratégique pourrait expliquer l'effet inhibiteur du NO sur l'activité enzymatique de CDC48. La dernière partie de ce travail a été centrée sur l'analyse des mécanismes par lesquels le NO active la protéine kinase NtOSAK (Nicotiana tabacum stress activated protein kinase) chez le tabac. Nous avons démontré que NtOSAK forme un complexe constitutif avec la glycéraldéhyde 3 phosphate deshydrogénase (GAPDH). En réponse à un stress salin, le NO promeut l'activation de NtOSAK via la phosphorylation de deux résidus serine localisés dans la boucle d'activation de l'enzyme. De plus, il induit une S-nitrosylation rapide de la GAPDH, ce processus n'affectant pas la formation du complexe. Notre hypothèse est que ce complexe constituerait une plateforme de signalisation régulée par le NO et pouvant recruter les protéines cibles de NtOSAK lors de la réponse au stress salin