Development of crosslinked nanofiber mats from alginate and poly(ethylene oxide) for tissue-engineering applications

Tissue engineering is a multidisciplinary field that aims to design and manufacture artificial tissues or whole organs to restore or replace the damaged ones. The development of suitable material for tissue engineering is very challenging, since it should resemble the extracellular matrix, have the desired mechanical properties, be biocompatible, biodegradable and cause no adverse immune response from the host. Thus, the aim of this master thesis was the development, stabilization and characterisation of nanofibers from biocompatible hydrophilic polymers. Electrospun (nano)fiber mats (ENM) were prepared by electrospinning of alginate/poly(ethylene oxide) (PEO) solution. To stabilise ENM, we tested different crosslinking methods, such as UV irradiation and γ-irradiation using 4-hydroxybenzophenone as crosslinker and ionic crosslinking with Ca2+ ions. We investigated the effects of crosslinking on the ENM using Fourier-transform infrared spectrometry and differential scanning calorimetry. The stability of the ENM was tested in 0.01 M phosphate buffered saline at 37 °C to imitate physiologically relevant conditions. We also evaluated the ENM stability and the biocompatibility of ENM with eukaryotic cells using hamster kidney fibroblasts (BHK-21 cell line). We successfully developed ENM with alginate/PEO ratio 50:50. The best stability of ENM was achieved with a combination of UV irradiation and ionic crosslinking with a 10% (w/V) CaCl2 solution, while γ-irradiation combined with ionic crosslinking or the use of a single method failed to stabilise the mats. Moreover, too high irradiation dose resulted in degradation of the mats. After 24 h of incubation, swelling degree was determined either for a single layer of ENM or for two or three superimposed layers ENM. The highest swelling degree of 2897% was calculated for one layer, but the best long-term stability was achieved by stacking three layers of ENM, which remained intact for 11 days. The MTS assay showed no statistical difference in cell viability between our mats and gelatine- based nanofiber mats, which are known to be biocompatible. The good biocompatibility and stability of the crosslinked alginate/PEO-based ENM demonstrate their high potential for further research and use as scaffolds for tissue engineering.Namen tkivnega inženirstva je razvoj in izdelava umetnih tkiv in organov, ki se obnašajo kot naravna in bi jih lahko uporabili za presaditev. Nanovlakna so zelo dolga vlakna z izredno majhnim premerom in potencialom za uporabo kot oporni nosilci pri tkivnem inženirstvu. Zaradi majhnega premera imajo zelo veliko površino glede na volumen in posledično izboljšane lastnosti v primerjavi z drugimi oblikami istega materiala. Nanovlakna za uporabo na področju biomedicine morajo biti biokompatibilna in biorazgradljiva, prav tako ne smejo sprožiti imunskega odziva. Navadno so izdelana z elektrostatskim sukanjem raztopine. Alginska kislina je polisaharid naravnega izvora in je široko uporabljan v medicinski, kozmetični in prehrambni industriji. Ker je nestrupen, biokompatibilen in biorazgradljiv, je potencialno primeren za izdelavo nanovlaken. Zaradi anionske narave elektrostatsko sukanje čiste raztopine alginata ni možno in je navadno v raztopino dodan sintezni polimer, npr. polietilenoksid (PEO), ki zmanjša odboj med alginatnimi verigami in tako omogoči omenjen proces. Naš namen v tej magistrski nalogi je bil razvoj, stabilizacija in vrednotenje nanovlaken izdelanih iz alginata in PEO. Takšna nanovlakna se raztopijo v vodi zaradi hidrofilnosti obeh polimerov, kar pa ni zaželeno za namene tkivnega inženirstva in zato smo proučili različne metode premreževanja nanovlaken za stabilizacijo ter s pomočjo vrednotenja formulacij izbrali najprimernejšo metodo. Dodatno smo želeli preveriti tudi biokompatibilnost najoptimalnejšega vzorca na celicah. Prvi del raziskave je bil izveden v Sloveniji, na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani, drugi del pa v Estoniji, na Inštitutu za farmacijo, Univerze v Tartuju. Iz vodnih raztopin aliginata in PEO, ki smo jim spreminjali celokupno koncentracijo polimerov v raztopini (3.50 % in 4.00 % (m/m)), razmerje med polimeroma (Alg:PEO = 50:50 in 90:10) ter molekulsko maso PEO (2 MDa in 4 MDa), smo izdelali različne formulacije nanovlaken. Morfologijo (nano)vlaken smo vrednotili z vrstičnim elektronskim mikroskopom. Za stabilizacijo alginata v vlaknih smo uporabljali ionsko premreževanje z raztopino CaCl2 (2 % ali 10 % (m/V)), za premreževanje PEO pa smo uporabljali UV obsevanje (obsevanje vlaken za različen čas ali obsevanje med elektrostatskim sukanjem) ter γ obsevanje vlaken. Strukturne spremembe, ki so nastale kot posledica premreževanja, smo analizirali s Fourerovo transformirano infrardečo svetlobo (FTIR) ter diferenčno dinamično kalorimetrijo (DSC), uspešnost stabilizacije pa smo preverjali z inkubacijo vlaken v pufru (0.01 M PBS, pH 7.4) pri 37 °C. Stabilnim membranam iz vlaknen smo določili stopnjo I I nabrekanja po 24 h ter dolgoročno stabilnost po 11 dneh inkubacije. Preverjali smo tudi, ali je razlika, če uporabimo eno, dve ali tri plasti membran iz vlaken. Na koncu smo preverjali še citotoksičnost za evkariontske celice, pri čemer smo uporabljali ledvične fibroblaste mladiča hrčka (BHK-21). Citotoksičnost smo preverjali z dvema različnima metodama MTS testaindirektno ter direktno. V prvem primeru smo ločeno inkubirali fibroblaste in membrane iz vlaken ter potem zamenjali medij fibroblastom s tistim od vlaken. Kot kontrolo smo uporabljali celični medij. Tako smo želeli preveriti, ali se iz vlaken sproščajo toksične substance. Pri direktni metodi smo fibroblaste inkubirali skupaj z membranami iz vlaken, saj je tudi morfologija vlaken pomemben faktor pri adheziji in proliferaciji celic. Kot kontrola so bila uporabljena membrane iz nanovlaken iz želatine, ki so dokazano biokompatibilna. Celično živost na vlaknih iz alginata in PEO smo podali relativno glede na celično živost na vlaknih iz želatine, preverjali pa smo tudi ali je kakšna razlika če uporabimo eno ali tri plasti vzorca. Nanovlakna F5, pripravljena iz 3.50 % (m/m) raztopine alginata in 4 MDa PEO v razmerju 50:50, so imela povprečni premer 230 nm, zato smo jih izbrali za nadaljevanje raziskav, ki so potekale v Estoniji. Zaradi drugačne naprave za elektrostatsko sukanje v tujini in spremenjenih okolijskih parametrov, nam ni uspelo popolnoma reproducirati prvotne morfologije, saj so imela vlakna izdelana v Estoniji večji premer, ki je znašal 1250 nm. S takšnimi vlakni smo nadaljevati raziskavo. Za premreževanje alginata v membranah iz vlaken smo uporabili ionsko premreževanje, vendar so takšne membrane hitro razpadle v pufru pri 37 °C, saj se je v njem vodotopni PEO raztopil. Posledično smo se odločili premrežiti še PEO, za kar smo izbrali kovalentno premreževanje s pomočjo UV oz. γ obsevanja ob prisotnosti fotoiniciatorja 4-hidroksibenzofenona. V primeru kombinacije različnih metod premreževanja smo najprej izvedli obsevanje in šele nato ionsko premreževanje. Ugotovili smo, da med obsevanjem sočasno s premreževnjem PEO poteka razgradnja polimerov, zato predolga izpostavljenost obsevanju destabilizira membrane iz vlakenna otip so bolj krhke, opaziti pa je možno tudi spremembo barve iz bele v rahlo rumeno. Prekratek čas obsevanja rezultira v nezadostni premreženosti in posledično nestabilnosti membran iz vlaken v pufru. Za najbolj optimalen čas obsevanja z UV svetlobo je bi 10 min na vsaki strani membrane, za popolno stabilizacijo pa je obsevanju sledilo še ionsko premreževanje z 10 % (m/V) raztopino CaCl2. Stabilne membrane iz vlaken so po 24 h inkubacije v 0.01 M PBS pri 37 °C zelo močno nabrekale, vendar ANOVA test ni pokazal statistično signifikantne razlike med enoplastnimi II I (2897 %SD = 1410 %), dvoplastnimi (2115 %SD = 806 %) in troplastnimi vzorci (2774 %SD = 568 %). V testu dolgoročne stabilnosti je 58.3 % enoplastnih, 83.3 % dvoplastnih ter 100 % troplastnih vzorcev ostalo stabilnih vseh 11 dni. Po prvih 24 h je mokra masa membran iz vlaken s časom padala, predvsem na račun raztapljanja alginata. Do tega pride zaradi izmenjave Ca2+ ionov z monovalentnimi ioni iz pufra, npr. z Na2+ ioni. Celična živost v indirektnem testu citotoksičnosti je znašala 88.7 %, ta vrednost pa ni bila statistično različna od kontrole, kar pomeni, da se iz vlaken niso izločale citotoksične substance. Rezultat direktnega testa citotoksičnosti pa je znašal 95.6 % za enoslojne in 112.0 % za troslojne membrane iz vlaken v primerjavi z živostjo celic na vlaknih iz želatine. Z ANOVA testom, ki ni pokazal statistično signifikantne razlike med uporabo ene ali treh plasti, smo pa ugotovili, da je rezultat statistično primerljiv z živostjo celic na membranah iz želatinskih vlaken (100 %), kar pomeni, da so tudi dotična vlakna biokompatibilna. Zaključujemo, da je za stabilizacijo vlaken iz alginata in PEO najbolj učinkovita kombinacija dveh metod, premreževanja z UV obsevanjem ob prisotnosti fotoiniciatorja 4-hidroksibenzofenona in ionskega premreževanja s CaCl2. Takšna vlakna so v 0.01 M PBS pri 37 °C obstojna več dni in niso citotoksična, zato so primerna za nadaljnje raziskave za namene tkivnega inženirstva