Study about the adherence to epithelial cells by uropathogenic Escherichia coli with phenotypic and genotypic markers of enteroaggregative E. coli.

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um importante patotipo diarreiogênico, enquanto E. coli uropatogênica (UPEC) é o agente mais importante de infecção do trato urinário (ITU). Nos últimos anos, fatores de virulência de EAEC têm sido detectados em cepas de E. coli causadoras de ITU, mostrando a importância dessas cepas híbridas. Nesse sentido, um estudo prévio identificou a presença de marcadores genéticos de EAEC (aatA, aap e pet) e o padrão de adesão agregativa (AA) na cepa UPEC-46, isolada de ITU. No presente estudo, a cepa UPEC-46 foi analisada genotípica e fenotipicamente com o objetivo de identificar a(s) adesina(s) responsável(eis) pelo estabelecimento do padrão AA e seu papel na patogênese bacteriana. O fenótipo AA foi observado para a UPEC-46 nos ensaios de adesão com as inhagens de células HeLa, HT-29 e 5637, após 3 ou 6 h de interação bactéria-células; entretanto, a formação de biofilme não foi detectada sob diferentes condições de cultivo ou superfícies abióticas. Adicionalmente, foram detectadas as produções de curli, celulose, bacteriocinas, toxina Pet e de resistência à atividade bactericida do soro humano. O genoma completo dessa cepa foi sequenciado e as análises de bioinformática mostraram que essa cepa está filogeneticamente relacionada a cepas de EAEC atípicas, isoladas de fezes humanas e com perfis de virulência semelhantes. As sequências de três plasmídios foram identificadas e montadas. No plasmídio p46-1, de maior peso molecular (~135 kb), foram localizados os genes de EAEC (aatA, pet e aap) e os genes responsáveis pela biogênese do pilus denominado aggregate-forming pili (AFP). No plasmídio p46-2 (~109 kb) foram identificados os genes de resistência a antimicrobianos e no plasmídio p46-3 (~9 kb) os genes responsáveis pela síntese da colicina E1. A mutação no gene afpA, que codifica a pilina de AFP, na UPEC-46 levou à perda de produção e montagem dessa fímbria e redução significativa na adesão às células epiteliais. Para identificar outras possíveis adesinas envolvidas no padrão AA produzido pela UPEC-46, uma biblioteca de mutantes usando o transposoma EZ-Tn5 foi obtida e os mutantes analisados. As inserções do transposon foram sequenciadas nos mutantes não aderentes, identificando genes relacionados à síntese de lipopolissacarídeos, metabolismo/transportadores celulares e às adesinas AFP e fímbria tipo 1. Construções genéticas a partir da cepa selvagem UPEC-46 mutagenizando os genes afpA (pilina da AFP) e fimH (pilina da fímbria tipo 1) foram analisadas em modelos in vitro (adesão e invasão) e in vivo (colonização intestinal em camundongos BALB/c e infecção ascendente do trato urinário em camundongos C57/BL6). Foi evidenciado o efeito sinérgico das adesinas AFP e fímbria tipo 1 no estabelecimento da aderência e na capacidade de invasão utilizando as linhagens celulares HeLa, HT-29 e 5637. Além disso, ambas as adesinas atuaram de forma conjunta na colonização intestinal e do trato urinário nos modelos murinos. Em conclusão, os dados obtidos no presente estudo permitem classificar a UPEC-46 como uma cepa híbrida patogênica que expressa a fímbria AFP, a qual apresenta papel essencial nos processos de adesão in vitro e de colonização intestinal e do trato urinário in vivo.Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) is an important diarrheagenic pathotype, while uropathogenic E. coli (UPEC) is the most important agent of urinary tract infection (UTI). Recently, EAEC virulence factors have been detected in E. coli strains causing UTI, showing the importance of these hybrid strains. In this sense, a previous study identified the presence of EAEC genetic markers (aatA, aap and pet) and the aggregative adhesion (AA) pattern in the UPEC-46 strain, isolated from UTI. In this study, the UPEC-46 strain was analyzed genotypically and phenotypically in order to identify the adhesin(s) responsible for establishing the AA pattern and its(their) role in pathogenesis. The AA pattern was observed for UPEC-46 in the adhesion assays using HeLa, HT-29 and 5637 cell lineages, after 3 or 6 h of bacterial-cell interaction. However, biofilm formation was not detected using different growth conditions or abiotic surfaces. Additionally, production of curli, cellulose, bacteriocins and Pet toxin were detected and the UPEC-46 was capable to resist to the bactericidal activity of normal human serum. The complete genome of UPEC-46 was sequenced, and bioinformatics analyzes showed that this strain is phylogenetically related to atypical EAEC strains, isolated from human feces with similar virulence profiles. The sequences of three plasmids were identified and assembled. The plasmid p46-1, presenting the higher molecular weight (~135 kb), harbors the EAEC genes (aatA, pet and aap) and the genes responsible for the pilus biogenesis called aggregate-forming pili (AFP). In the plasmid p46-2 (~109 kb), genes encoding for antimicrobial resistance were identified; while the plasmid p46-3 (~9 kb) harbors the genes responsible for the synthesis of colicin E1. The mutation of afpA, the gene encoding the AFP pilin, led to loss of production and assembly of this fimbria and a significant reduction in the adherence to epithelial cells in the UPEC-46. To identify other possible adhesins involved in the AA pattern produced by UPEC-46, a library of mutants using the transposome EZ-Tn5 was obtained and the mutants analyzed. Transposon insertions were sequenced in non-adherent mutants, identifying genes related to the synthesis of lipopolysaccharides, metabolism/cellular transporters and the adhesins AFP and type 1 fimbriae. Genetic constructions from the wild-type strain (UPEC-46) mutating the afpA (AFP pilin) and fimH (type 1 fimbriae pilin) genes were analyzed in vitro (adhesion and invasion) and in vivo (intestinal colonization in BALB/c mice and ascending urinary tract infection in C57/BL6 mice). It was evidenced the synergistic effect of AFP and type 1 fimbriae adhesins in the adherence and invasion phenotypes using HeLa, HT-29 and 5637 cell lineages. In addition, both adhesins acted together in intestinal and urinary tract colonization using murine models. In conclusion, the data obtained in the present study allow us to classify the UPEC-46 as a hybrid-pathogenic strain that expresses the AFP fimbriae, which plays an essential role in the processes of adhesion in vitro and intestinal and urinary tract colonization in vivo