Structural studies of enzymes involved with cyclizations in antibiotic biosynthesis pathways.

Os produtos naturais são uma fonte de compostos bioativos utilizados pelo homem para o tratamento de diversas doenças. Apesar do campo da química biológica ter avançado consideravelmente no entendimento de como a natureza produz vários desses compostos, ainda há muitos eventos pouco compreendidos. Atualmente esse campo de pesquisa tem ganhado a atenção da comunidade científica devido ao crescente interesse no entendimento das enzimas relacionadas com a biossíntese de produtos naturais e, também, devido a sua aplicabilidade em programas de biologia sintética para a produção de novos compostos. A formação de anéis heterocíclicos em produtos naturais é um dos eventos em que os mecanismos moleculares não são claramente conhecidos. O objetivo deste trabalho é caracterizar estruturalmente diferentes enzimas responsáveis pela biossíntese de anéis heterocíclicos por cristalografia de raios-X. Um aspecto interessante e único da biossíntese de poliéteres ionóforos é a formação de anéis centrais aparentemente formados por um mecanismo utilizando Diels-alderases. Já para os anéis benzoxazóis, uma ligase dependente de ATP e uma amidohidrolase parecem estar envolvidas na formação do anel. A enzima AjiA1 que participa na formação de um anel benzoxazol e as proteínas ciclases Tmn9 e Tsn15 responsáveis pela formação de anéis em poliéteres ionóforos tetronatos são estudadas neste trabalho. As análises estruturais da enzima AjiA1 indicam que essa enzima possui um conjunto de movimentos completamente novo durante o ciclo catalítico nos membros das AFEs (Adenylate-Forming Enzymes). A alternância de domínio não deve ocorrer nessa enzima, já que ela apresenta um evento de troca de domínio envolvendo uma alça C-terminal longa (loop swapping) que restringe o domínio C-terminal e bloqueia a enzima em uma única conformação. A estrutura de Tsn15 em complexo com seu intermediário de reação e a estrutura da enzima Tmn9 em complexo com seu cofator FAD foram determinadas. Tsn15 e Tmn9 são estruturalmente homólogas às ciclases conhecidas como Diels-alderases. Apesar das reações Diels-Alder ocorrerem espontaneamente em água, nossos estudos evidenciam que a presença da enzima favorece a ocorrência da ciclização, permitindo que o substrato adquira uma posição favorável para a ocorrência da reação. A descrição dessas enzimas e as análises realizadas neste trabalho representam um avanço significativo no entendimento da biossíntese de diferentes produtos naturais.Natural products are a source of bioactive compounds used by men to treat various diseases. Although the field of biological chemistry has advanced considerably in the understanding of how nature produces several of these compounds, there are still many events not sufficiently understood. Currently, this research area has gained the attention of the scientific community due to the growing interest in understanding the enzymes involved in the biosynthesis of natural products and, also, due to its applicability in synthetic biology programs aiming at the production of new compound derivatives. The formation of heterocyclic rings in natural products is one of the events in which the molecular mechanisms are not clearly known. The objective of this work was to structurally characterize different enzymes involved in the biosynthesis of natural products heterocyclic rings through protein X-ray crystallography. An interesting and unique aspect of ionophore polyether biosynthesis is the formation of central rings which are catalyzed by Diels-alderases. For benzoxazole antibiotics, an ATP-dependent ligase and an amidohydrolase appear to be involved in the formation of the ring. The enzyme AjiA1 that participates in the formation of a benzoxazole ring and the cyclases Tmn9 and Tsn15 that are responsible for the formation of a pyran and a cyclohexane rings in tetronate containing ionophore polyethers are studied in this work. Structural analyzes of AjiA1 indicate that this enzyme has a completely new set of movements during the catalytic cycle, which is different from the other AFE family members (Adenylate-Forming Enzymes). Domain alternation should not occur in this enzyme, in contrast to the other members of this family, and instead, AjiA1 has a domain change event involving a long C-terminal loop (loop swapping) that restricts the C-terminal domain and blocks the enzyme in a single conformation. The structure of Tsn15 in complex with its reaction intermediate and the structure of the enzyme Tmn9 in complex with FAD coenzyme were determined. Both Tsn15 and Tmn9 are structurally homolog to cyclases known as Diels-alderases. Although the Diels-Alder reactions occur spontaneously in water, our studies propose that the presence of the enzyme favors the cyclization since the substrate can acquire a favorable position in the protein lumen for the reaction to occur. The description of these enzymes and the analyzes carried out in this work represent a significant advance in the understanding of the biosynthesis of different natural products