Structural and functional studies of the transcriptional regulator PhoB in Xanthomonas citri.

Xanthomonas citri pv. citri e um fitopatógeno causador do cancro cítrico, doença que afeta diversas espécies de citros. O fosfato inorgânico (Pi), envolvido em diversos processos fisiológicos, necessita de uma fina manutenção dos seus níveis nas células bacterianas ativando genes pertencentes ao denominado Pho regulon. Foi demonstrado anteriormente que ao menos 30 genes pertencentes ao Pho regulon estão presentes em X. citri, incluindo o sistema dois componentes PhoR-PhoB e o sistema de captação de fosfato PstSCAB. PhoR-PhoB é composto de uma proteína sensora quinase (PhoR) que sente as flutuações na concentração do fosfato no meio, ativando a proteína reguladora PhoB que efetuara a regulação positiva da transcrição de genes relacionados a captura e ao metabolismo do fosfato. O presente estudo teve como alvo a caracterização estrutural e funcional da proteína PhoB de Xanthomonas citri, da qual não havia nenhum tipo de informação. Análises de bioinformática mostraram que PhoB de X. citri pertence à subfamília OmpR/PhoB de reguladores de resposta e conserva os motivos funcionais e resíduos essenciais para ativação por fosforilação, associação ao DNA e reconhecimento pela RNA polimerase. A proteína foi expressa solúvel em células de Escherichia coli BL21 (DE3) STAR e purificada por cromatografia de afinidade ao níquel, seguida por exclusão molecular, na forma monodispersa, estável em pH neutro e, na presença de Mg2+, mantém atividade de ligação ao DNA. Ensaios de dicroísmo circular e gel shift, indicaram que PhoB é capaz de interagir com regiões phobox presentes em DNA plasmidiano, com mudanças estruturais que levam ao aumento do conteúdo de estrutura secundária. A conformação avaliada por espalhamento de raio-X a baixo ângulo, confirma a presença de dois domínios unidos por uma junção estreita e flexível, o que dificultou a sua cristalização. Adicionalmente, também avaliamos que houve a ativação das regiões promotoras dos operons pstSCABphoU e oprOphoX, in vitro em meio A com fosfato (indutor do Pho regulon) e in vivo em folhas de Citrus sinensis, sugerindo a ativação de PhoB e sua relevância para o crescimento da bactéria e processo de infecção. Os dados obtidos nesse trabalho, trazem o primeiro conjunto de resultados sobre o regulador PhoB de X. citri, e informações sobre seu mecanismo de ação e ativação durante a infecção in vivo. Devido à alta conservação da proteína no gênero, os resultados podem ser extrapolados para outras espécies. Futuros estudos devem avaliar o papel de PhoB utilizando linhagens mutantes.Xanthomonas citri pv. citri is a phytopathogen that causes citrus canker, a disease that affects several citrus species. Inorganic phosphate (Pi), involved in several physiological processes, requires a fine maintenance of its levels in bacterial cells by activating genes belonging to the so-called Pho regulon. It has been previously shown that at least 30 genes belonging to the Pho regulon are present in X. citri, including the two-component PhoR-PhoB system and the PstSCAB phosphate uptake system. PhoR-PhoB is composed of a sensor protein kinase (PhoR) that senses fluctuations in the concentration of phosphate in the medium, activating the regulatory protein PhoB that will effect the positive regulation of transcription of genes related to phosphate capture and metabolism. The present study aimed at the structural and functional characterization of the PhoB protein from Xanthomonas citri, of which there was no information. Bioinformatics analyzes showed that PhoB of X. citri belongs to the OmpR/PhoB subfamily of response regulators and retains the functional motifs and essential residues for activation by phosphorylation, association with DNA and recognition by RNA polymerase. The protein was expressed soluble in Escherichia coli BL21 (DE3) STAR cells and purified by nickel affinity chromatography followed by size exclusion chromatography, in monodispersed form, stable at neutral pH and, in the presence of Mg2+, maintains DNA binding activity. Tests of circular dichroism and gel shift, indicated that PhoB is capable of interacting with phobox regions present in plasmid DNA, with structural changes that lead to an increase in the content of secondary structure. The conformation evaluated by X-ray scattering at low angle, confirms the presence of two domains joined by a narrow and flexible junction, which made it difficult to crystallize. Additionally, we also evaluated the activation of the promoter regions of the pstSCABphoU and oprOphoX operons, in vitro in medium A with phosphate (Pho regulon inducer) and in vivo in leaves of Citrus sinensis, suggesting the activation of PhoB and its relevance for growth bacteria and infection process. The data obtained in this work bring the first set of results about the PhoB regulator of X. citri, and information about its mechanism of action and activation specially during in vivo infection. Due to the high conservation of the protein in the genus, the results can be extrapolated to other species. Future studies should evaluate the role of PhoB using mutant strains