Modélisation d'une forme de rétinite pigmentaire et validation d'une approche de thérapie génique, à l'aide de cellules rétiniennes dérivées de cellules iPS humaines

Generation of retinal cells from human iPS cells offers the opportunity to study the effects of specific disease-causing mutations in an in vitro human system. Our project consisted of modeling specific form of Retinits Pigmentosa (RP) using patient iPS cells. We first optimized a differentiation protocol to obtain retinal organoids with a structural organization closer to the retina in vivo, allowing advanced photoreceptor maturation. Using this tool, we were able to fully recapitulate the RP phenotype (degeneration of rods and cones), observed in patients with mutation in RHODOPSINE gene, coding for the visual pigment. Then, we used the same approach to understand the pathogenicity of RP related to mutations in PRPF31 gene, coding for a splicing factor. Retinal organoids summarized the degeneration of mature rods and secondary loss of cones, as observed in patients. Furthermore, PRPF31-mutated retinal pigmented epithelial cells exhibited also structural and functional defective phenotype. These retinal degenerative phenotypes are correlated with a lower level expression of PRPF31 protein, linking causal mutations to an haploinsufficiency mechanism. We thus have developed a gene augmentation strategy, bringing an additional wild type copy of PRPF31 through CRISPR/Cas9 or using an AAV vector, that both allowed the rescue of retinal cell degeneration.Notre projet consiste à modéliser une forme spécifique de rétinite pigmentaire (RP) en utilisant des cellules iPS de patients. Nous avons d'abord optimisé un protocole de différenciation pour obtenir à partir de cellules iPS des organoïdes rétiniens avec une organisation structurelle plus proche de la rétine in vivo, permettant une maturation avancée des photorécepteurs. Cet outil nous a permis de récapituler entièrement le phénotype RP (dégénérescence des bâtonnets et des cônes), observé chez les patients présentant une mutation du gène RHODOPSINE, codant pour le pigment visuel. Nous avons ensuite utilisé la même approche pour comprendre la pathogénicité des RP liées à des mutations du gène PRPF31, codant pour un facteur d'épissage. Les organoïdes rétiniens ont résumé la dégénérescence des bâtonnets et la perte secondaire des cônes, observées chez les patients. Les cellules de l'épithélium pigmenté de la rétine présentaient également des défauts organisationnels et fonctionnels. Ces phénotypes dégénératifs rétiniens sont corrélés à un niveau d'expression plus faible de la protéine PRPF31, liant la pathogénicité à un mécanisme d'haploinsuffisance. Nous avons donc développé une stratégie d'augmentation du gène, en apportant une copie fonctionnelle de PRPF31 par CRISPR/Cas9 ou en utilisant un vecteur AAV, qui ont permis le sauvetage de la dégénérescence des cellules rétiniennes