Nanotecnologie applicate alla chirurgia protesica dei difetti della parete addominale. Tesi Sperimentale sulle possibili Applicazioni delle Nanotecnologie alla Chirurgia Generale: sviluppo di biomateriali protesici. Risultati preliminari dopo tre anni di sperimentazione.

La chirurgia dei difetti della parete addominale (ernia inguinale, ernia ombelicale, ernia ventrale) utilizza materiali protesici con metodica “tension free” al fine di ridurre il rischio di recidiva erniaria, di migliorare il confort postoperatorio, ridurre il dolore, abbreviare la degenza ospedaliera ed accelerare la ripresa delle attività personali del Paziente. In tale ambito molti ricercatori stanno lavorando al fine di identificare un tessuto sintetico con il quale si possa realizzare la “Protesi Ideale”. Tra le caratteristiche che dovrebbero essere possedute dalla protesi ideale, la reazione infiammatoria di cicatrizzazione ed incorporazione da parte dei fibroblasti dovrebbe essere modulata e controllabile e comunque il più possibile vicina al processo cicatriziale fisiologico. Il vecchio ma ben noto polipropilene, potrebbe trovare una nuova vita se si potessero realizzare protesi più leggere, con reti più sottile, al fine di impiantare una minore quantità di materiale estraneo ma, comunque in grado di resistere alle sollecitazioni ed impedire la recidiva. I nuovi materiali dovrebbero quindi rispondere alle caratteristiche di leggerezza, resistenza, biocompatibilità, economicità, reazione infiammatoria controllabile, maggior confort per i pazienti e se possibile, riduzione dei tempi operatori per l’impianto. Altra caratteristica importante di una rete ideale, è quella di garantire il corretto e stabile posizionamento dell’impianto fin dal primo momento e per tutto il periodo di tempo necessario all’incorporazione nel tessuto infiammatorio cicatriziale. Tra i tantissimi materiali disponibili sottoposti all’attenzione della comunità scientifica, i nanoderivati del carbonio sono forse, attualmente, quelli più diffusamente studiati per la grande potenzialità e versatilità dimostrata. Scopo di questa ricerca è stato quello di verificare la possibilità di applicare le nanotecnologie e i nuovi bionanomateriali alla Chirurgia Generale. Nel lungo periodo intendiamo tentare di realizzare una nuova generazione di tessuti protesici di interesse Chirurgico, ed un nuovo materiale bioadesivo, sviluppati sulla base delle conoscenze e dei risultati acquisiti nel corso di queste ricerche. Come il minatore che nel seguire il filone di rame s’imbatte in uno strato contenente oro, non lo ignora semplicemente perché non si tratta del metallo che sta estraendo dal filone, analogamente abbiamo trovato cose nuove ed importanti e le abbiamo quindi approfondite, ma non fanno parte della presente dissertazione e quindi i dati non sono stati riportati nel presente documento. Abbiamo potuto osservare e documentare l'elevata versatilità dei nanomateriali tra i quali, i nanotubi di carbonio multiparete (Multi Walled Carbon Nano Tubes- MWCNT) che sono stati studiati approfonditamente per quanto riguarda i loro effetti biologici e il Buckypaper (BP), una speciale conformazione dei MWCNT sotto forma di deposito in strato sottile. Il BP di MWCNT è un primo passo per la realizzazione di una nuova generazione di tessuti protesici che a parità di prestazioni biotensili e fisicochimiche possono essere almeno 10 volte più leggeri e bioadesivi, rispetto a quelli attualmente in commercio. Abbiamo scoperto, infatti, che le due superfici del BP hanno caratteristiche e proprietà biologiche diverse. Un lato è liscio e lucente e non manifesta spiccata bioadesività. Il lato opposto, opaco e ruvido, manifesta invece un’energica bioadesività descritta e documentata dal nostro gruppo di ricerca e oggetto di brevetto, approvato dall’Ufficio Brevetti dell’Università degli Studi di Roma “Sapienza”. Tale bioadesività può essere sfruttata sia per realizzare dei supporti per fissare i comuni tessuti protesici in commercio ai tessuti viventi, sostituendo gli attuali metodi di ancoraggio, sia nell’impiego del BP tal quale, di profilo e dimensioni idonei alla funzione protesica. La ricerca si è articolata nel corso dei tre anni a disposizione per il Dottorato così come di seguito rappresentato: abbiamo iniziato con l’approfondita analisi sulla biotossicità dei nanomateriali, effettuate “in vitro” presso il Laboratorio del Dipartimento “Pietro Valdoni” dell’Università degli Studi di Roma “La Sapienza”, sito in Via Scarpa, e di caratterizzazione presso l’Istituto di Fisica Nucleare (INFN) di Frascati, ai Laboratori del quale il sottoscritto Dottorando ha potuto accedere previa speciale autorizzazione. I MWCNT ed il BP sono stati caratterizzati all’infrarosso (IR), al microscopio elettronico a scansione (SEM) e al microscopio a trasmissione elettronica (TEM), prima e dopo sterilizzazione con varie metodiche al fine di impiantare materiali sterilizzati, per ridurre i fattori di confondimento. Presso lo stabulario del Dipartimento di Farmacologia “Vittorio Ersparmer” dell’Università degli Studi di Roma “La Sapienza” sono stati eseguiti tests di biotossicità dei MWCNT “In vivo”, utilizzando 12 cavie da laboratorio e 2 ratti Sprague Dawley. I risultati di tali esperimenti, compresi quelli anatomopatologici sono stati pubblicati sulla rivista internazionale “Journal of Physics-Condensed Matters”. In una seconda fase ci siamo dedicati a studiare il Buckypaper (BP), una delle particolari conformazioni aggregative dei MWCNT. Abbiamo studiato la mutagenicità su batteri che ha prodotto una seconda pubblicazione sulla revista internazionale “Toxicology”. Analogamente aquanto eseguito nel corso del primo ciclo, abbiamo studiato gli effetti citotossici di frammenti di BP su vari cloni cellulari e successivamente abbiamo eseguito impianti di BP tal quale, su 30 ratti maschi Sprague Dawley, realizzando il protocollo sperimentale presso lo stabulario di Via Scarpa, autorizzato dal Ministero della Salute, in accordo con il Servizio Veterinario per il benessere animale dell’Università di Roma “La Sapienza” e supervisionato dall’Istituto Superiore di Sanità (ISS). Tali risultati sono stati pubblicati sulla Revista internazionale “Nanomedicine”. Nel terzo ciclo sperimentale abbiamo reiterato lo stesso protocollo, già autorizzato, realizzato nello stabulario dell’ISS eseguendo test ematochimici in vivo, per un totale di 3400 esami. Tali esami sono stati effettuati presso Appialab, un laboratorio analisi veterinarie privato di Roma, al fine di valutare l’interferenza del BP sia con il sistema immunitario che con tutti gli emuntori, su altri 30 ratti maschi Sprague-Dahuley di taglia compresa fra i 200 ed i 550 grammi. Abbiamo, inoltre, valutato la tossicità sui parenchimi, nell’animale vivo e su tutti i visceri nel corso del successivo esame anatomopatologico eseguito dopo il sacrificio degli animali, scadenzati dai cronoprogramma di seguito riportati. In tali ratti sono stati impiantati campioni di polipropilene da 2 cm2 ai cui angoli sono stati applicati quadratini da 2 mm2 e fissati con un punto in polipropilene. Tali impianti sono stati confrontati con l’effetto prodotto da: impianti di BP da 2 cm2, impianti di Parietene-Progrip da 2 cm2 e con impianti di polipropilene da 2 cm2. Settimanalmente, gli animali individuati secondo la tavola di randomizzazione, sono stati pesati, è stato eseguito il prelievo ematico e sacrificati, con espianto di tutti gli organi per gli esami anatomopatologico. Tale procedura si è protratta per 5 settimane, per studiare dettagliatamente il processo cicatriziale. In seguito, i campioni di BP prelevati dagli animali sacrificati, sono stati studiati per misurarne l’effetto bioadesivo, presso il laboratorio del Dipartimento di Chimica dell’Università degli Studi di Roma “La Sapienza”. In un successivo esperimento, abbiamo comparato la forza bioadesiva del BP, con: protesi in polipropilene commerciale e varie protesi in PTFE espanso e non espanso, fissate ai tessuti biologici con colla di fibrina e contro polipropilene rivestito con acido polilattico (per conferire adesività - grip). I test di laboratorio hanno mostrato che il BP aderisce molto bene al substrato biologico. Per quanto riguarda i test di confronto tra biomateriali, abbiamo osservato preliminarmente che il BP provoca solamente una lieve reazione infiammatoria, da parte dei tessuti viventi, rispetto alla reazione infiammatoria cicatriziale provocata dal polipropilene. Il BP mostra una buona tollerabilità da parte dei soggetti impiantati. La mortalità in tutti i soggetti impiantati e nei controlli è stata nulla. Infine, Abbiamo studiato alla microscopia elettronica i rapporti tra il margine cicatriziale del tessuto vivente ed il BP nel punto di contatto. CONCLUSIONI 8.1 Conclusioni  E’ necessario proseguire con lo studio dei MWCNT al fine di sviluppare un numero di casi statisticamente significativo.  Sebbene i SWCNT sono più costosi dovrebbe essere interessante studiarli con le stesse cellule e gli stessi animali e confrontando i risultati con quelli ottenuti nel presente studi sui MWCNT.  La citotossicità dei nanotubi di carbonio aumenta significativamente quando sulla loro superficie sono presenti gruppi carbonile (-CO), carbossile (-COOH), e/o idrossile (-OH). I nanotubi di carbonio possono indurre morte cellulare o per contatto o per internalizzazione ma l’esatto meccanismo resta al momento sconosciuto. Il presente lavoro non considera i nanotubi funzionalizzati, ma ci proponiamo di studiarli in un prossimo esperimento chiarificatore, specie per quanto riguarda l’interazione tra la superficie dei nanotubi e la superficie cellulare.  Tanto più alta è la concentrazione dei MWCNT tanto più bassa è la velocità di crescita delle cellule in coltura. In ogni modo le cellule del carcinoma colorettale Caco-2 sono insensibili alla presenza dei MWCNT. Sarebbe interessante capire questo meccanismo con successive ricerche dato che, al momento, non sono disponibili altre informazioni.  Non abbiamo trovato variazioni nell’assetto anticorpale e quindi le dosi di MWCNT somministrate, non sono pericolose per gli animali. Forse il sistema immunitario o non è attivato o è soppresso dalla tossicità dei MWCNT, ma non lo sappiamo ancora. Dobbiamo studiare la possibilità di utilizzare i MWCNT a scopo terapeutico.  A basso dosaggio i MWCNT non provocano risposte infiammatorie e questo è un dato interessante per la futura realizzazione per materiali protesici da impiegare in Chirurgia Generale.  Infine non è stato ancora studiato il potere carcinogenetico dei nanotubi di carbonio, cioè il potenziale di trasformazione di una cellula normale in una cellula tumorale, studio che necessita una dettagliata ricerca sul follow up. Negli ultimi 5 anni la questione della potenziale tossicità dei nanotubi di carbonio è stata frequentemente richiamata, in ogni caso il nostro studio mostra assenza di tossicità ai dosaggi di 5, 10 mg/kg−1 peso corporeo. Non sono stati osservati effetti immunologici alle alte dosi di 20, 40 mg/kg−1 di peso corporeo ed immaginiamo quindi, la possibilità di servirci dei nanotubi di carbonio come veicoli per molecole farmacologiche [28] e mezzi di contrasto per RMN [29], o materiale protesico. In ogni caso si raccomanda prudenza nella manipolazione di questi materiali fin tanto che non saranno disponibili notizie complete e dettagliate [30, 33, 34, 35]. 8.2 Conclusioni, sommario e sviluppi  Il presente lavoro riguarda gli effetti biologici del BP fabbricato a partire da MWCNT. Tali materiali sono stati sperimentati su 5 diverse linee cellulari umane in vitro, ed impiantati su topo di laboratorio. Attualmente siamo passati a sperimentare su ratto. Abbiamo studiato gli effetti biologici e la tossicologia in vitro and in vivo. L’argomento è, infatti, attualissimo e d’interesse nelle applicazioni biologiche dei nanomateriali e nanotecnologie ed è stato oggetto della recente pubblicazione di un volume [27]. Riteniamo, motivati dal gran numero di ricercatori impegnati in ricerche su nanoparticelle e nanomateriali, di importanza essenziale valutare il rischio potenziale per la salute umana, correlato all’esposizione giornaliera ai CNT e nanoparticelle.  Le conseguenze dell’esposizione ai CNT delle vie aeree (AEC) è stata studiata meno, rispetto a quella delle cellule macrofagiche, sebbene le vie aeree siano la prima barriera contro le nanoparticelle inalate. Caratteristica importante delle AEC è il mantenimento delle giunzioni intercellulari serrate (tight junctional complexes) che consentono la secrezione polarizzata e che previene l’ingresso di patogeni ed inquinanti chimici e può partecipare alla trasduzione di segnali nella regolazione dell’espressione genica [28]. Questa proprietà è mantenuta da molte cellule delle vie aeree quali CaLu-3, linea cellulare derivata dall’adenocarcinoma polmonare umano. Queste cellule hanno la capacità, se coltivate su filtro permeabile, di formare monostrati cellulari tra loro molto aderenti con resistenza elettrica trans-epiteliale (trans-epithelial electrical resistance-TEER) elevata, valutata >1000Ohm/cm2.  L’uso di linee cellulari CaLu-3 in esperimenti con SWCNT e MWCNT commerciali [29] a bassa contaminazione metallica, ha permesso l’osservazione che l’impiego di MWCNT ha provocato una progressiva riduzione del TEER, mentre utilizzando i SWCNT è stato osservata una riduzione meno spiccata ma ancora misurabile.  L’agginta di nanomateriali carboniosi, durante la fase di crescita e costituzione dei “tight functional complexes”, come testimoniato dal progressivo ridursi del TEER durante lo sviluppo del clone cellulare monostratificato CaLu-3, ha effetti sono strettamente dipendenti dal tipo di materiale impiegato. Ad esempio, i MWCNT hanno un profondo effetto inibitorio, sostanzialmente rappresentato dalla soppressione della formazione dei “ highresistance epithelium tight junctions”. La soppressione della funzione di barriera, è associata al parallelo aumento della permeabilità interstiziale del monostrato cellulare CaLu-3, al mannitolo, senza sostanziale riduzione della vitalità cellulare [29].  Il mantenimento dell’efficienza della funzione di barriera, è quindi una funzione importantissima per la prevenzione dalle malattie respiratorie e la determinazione dell’esposizione agli xenobiotici, simili ai MWCNT, può indurre modificazioni con importanti conseguenze funzionali, come l’aumento della suscettibilità ai patogeni, il passaggio dal compartimento respiratorio agli altri compartimenti corporei di inquinanti ambientali [28,29]. Tali influenze non dipendono dalla quantità dei materiali inquinanti inalati ma dal loro tipo, perché la conformazione superficiale condiziona enormemente la reattività chimica molecolare.  Altro argomento importante relativo ai rischi per la salute correlati all’esposizione ai CNT è il rischio mutageno [2]. Anche la tossicità dei MWCNT solubili in soluzione acquosa è stata trattata [5]. Il MWCNT possiede un piccolo volume ed un’enorme superficie di contatto, proprietà che sembrano essere implicate nella loro attività biologica [18].In definitiva è opportuno che la loro manipolazione avvenga con prudenza [30].  Abbiamo somministrato nanoparticelle sterilizzate a colture cellulari e impiantato BP sterilizzato su ratto. Gli effetti sulla cicatrizzazione, studiata lungo tutto il suo sviluppo a 7, 14, 21, 28 e 35 giorni dall’incisione chirurgica, sono stati studiati alla microscopia ottica. Non sono stati osservati effetti mutageni. Abbiamo studiato anche gli effetti del BP su 5 linee cellulari verificando gli effetti del BP sulla proliferazione cellulare dei 5 diversi citotipi umani: due da adenocarcinoma solido, Caco-2 e MCF-7, uno da leucemia HL-60 e due da cellule normali, HA-SMC (human arterial smooth muscle cells) e HF (human dermal fibroblasts). Queste ricerche hanno evidenziato che il BP ha indotto una significativa riduzione nella proliferazione cellulare delle linee Caco-2 e MCF-7 e la completa inibizione della HL-60 cell. Pensiamo che il BP abbia un effetto specifico sulle cellule trasformate, confermato dall’innocuità nei confronti delle altre due linee cellulari normali.  I presenti risultati sono utili nell’approfondimento delle conoscienze sulla innocuità del BP in vista delle sue possibili applicazioni. Comunque, per le future applicazioni mediche, potrebbe essere utile realizzare tessuti protesici a base di MWCNT e studiarne gli effetti nel soggetto impiantato. Il nostro gruppo di ricerca sta procedendo nelle ricerche sull’apoptosi e la cancerogenicità dei MWCNT, studi che richiedono dettagliati follow-up investigativi su specifiche problematiche. Sono in ogni caso necessari, ulteriori studi, in vista di successivi e più estesi impieghi dei MWCNT, specialmente nelle applicazioni mediche e biologiche in cui i MWCNT vengono iniettati per via endovenosa in umano, per la somministrazione di farmaci e come mezzo di contrasto per RMN [33, 34, 35 bibliografia 1 esperimento], o materiale base per una nuova generazione di tessuti protesici di interesse per la Chirurgia Generale.  In conclusione i risultati sopra presentati sugli effetti biologici del BP sono interessanti per la relativamente scarsa reazione flogistica manifestata all’impianto del BP. D’altra parte il BP ha avuto un effetto che sembrerebbe selettivo sulle linee cellulari utilizzate, innocuo sulle 2 normali e citotossico sulle tre neoplastiche. Non è ancora chiaro il meccanismo sottostante tale comportamento selettivo. Non sappiamo se dipende da un recettore superficiale cellulare che attivi il rilascio di sostanze antiproliferative o dipenda semplicemente dal tipo di interazione superficiale. Come possibile futuro sviluppo, pensiamo che sia indispensabile una migliore comprensione del fenomeno e che la comprensione dell’effetto selettivo del BP, vada sperimentato su animale con tumore solido corrispondente alle linee tumorali cellulari già studiate in vitro. Se vogliamo realizzare una nuova generazione di tessuti protesici e uno device antitumorale per il trattamento di specifici tumori solidi è quindi indispensabile, approfondire queste problematiche. 8.3 Conclusioni, sommario mutagenicita’ L’effetto mutageno dei MWCNT, caratterizzati da piccolissimo volume e grande superficie e con la presenza di impurità metalliche inferiori all’ 0.1%, è stata valutata con il test di Ames che serve a valutare la mutagenicità sul DNA modificato da mutazioni sulla Salmonella typhimurium sui ceppi TA 98 e TA 100 e sull’Escherichia coli ceppo WP2uvrA in presenza ed in assenza del sistema di attivazione metabolica S9. Un test di citotossicità è stato eseguito preliminarmente per accertare che non vi fosse alcuna tossicità che avesse potuto interferire con l’indagine sulla mutagenesi. I MWCNT sono risultati privi di effetto mutageno nei sistemi cellulari batterici testati, in cui il numero delle colonie ricombinanti non è aumentato significativamente. L’attività mutagenica non è comparsa nemmeno in presenza dell’attivatore metabolico, tanto che possiamo escludere che i MWCNT metaboliti, prodotti mediante il sistema ossidativo metabolico cytochrome-based P-450, può agire da mutageno. I nanomateriali a base di carbonio, sembrano esibire vari tipi di attività biologica e diversa tossicità in relazione alle loro caratteristiche fisicochimiche, dimensione, profilo, cristallinità e contaminanti metallici, così che è difficile stabilire la loro potenziale pericolosità, per la salute umana. A causa delle limitate conoscenze sulla genotossicità e l’aumentato numero di ricercatori esposti per motive professionali ai nanomateriali, i risultati del presente lavoro migliorano il grado di conoscenza, sulla sicurezza d’uso dei nanotubi di carbonio, in vista delle loro possibili applicazioni. 8.4 Conclusioni, biocompatibilita’ Il BP studiato con le nostre sperimentazioni, per quanto ne sappiamo, non è mai stato studiato, fino ad oggi, per le proprietà di bioadesività e biocompatibilità, perchè nasce come prodotto destinato alla microelettronica. A causa del sempre più diffuso impiego dei nanomateriali e del BP, in considerazione delle limitate conoscenze, attualmente esistenti, e del conseguente aumento dei rischi da esposizione professionale e pubblica ai nanomateriali. Sono necessari nuovi studi sulla bioadesività e sulla tossicità del BP. I dati riportati dalle nostre sperimentazioni possono essere utili ad estendere le conoscenze sulla innocuità del BP al fine di definirne il potenziale impiego in ambito chirurgico, verificando i potenziali rischi per la salute umana correlati alla esposizione al BP. In particolare, abbiamo osservato sia alla microscopia ottica sia con i test di trazione che l’effetto bioadesivo del BP è molto più energico dal suo lato opaco-ruvido rispetto al lato opposto, liscio, lucido che risulta debolmente bioadesivo. Inoltre il comportamento cambia in relazione allo stato di idratazione e dipende anche dalle caratteristiche del solvente. Infatti, il BP migliora la sua prestazione bioadesiva se idratato con soluzione fisiologica. Queste proprietà sono utilissime nell’impiego chirurgico, specialmente nelle procedure laparoscopiche, ma necessitano di verifica clinica e di grandi numeri per raggiungere una significatività statistica. Il lato opaco provoca una reazione cicatriziale da corpo estraneo con deposizione di fibroblasti, mentre il lato liscio-lucente, scarsamente adesivo determina la deposizione di uno strato fibroso che non aderisce alla superficie. Sembra inoltre, per la prima volta chiaramente documentato, che il BP non evidenzia effetti citotossici su cellule normali sane, ma induce pesanti effetti sulle linee cellulari CaCo2, MCF-7 e HL-60. Pensiamo di procedure con le indagini scientifiche per chiarire esaustivamente questi punti, ancora oscuri nei nostri prossimi lavori. Altro interessantissimo possibile sviluppo è l’impiego del BP a fini chirurgici ed una sperimentazione in questa direzione, con animali di maggior taglia