Evaluation of in vitro antimicrobial activity and in vivo effect on the progression of periapical lesions, through microscopic analysis

Os probióticos são micro-organismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro. Pesquisas em relação ao uso de probióticos para tratamento de doenças na cavidade bucal tem apresentado resultados relevantes. Entretanto, poucos estudos relatam o efeito do uso de probióticos nas infecções pulpares e nenhum estudo in vivo utilizou os probióticos como solução irrigadora de canais radiculares. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar, in vitro, a atividade antimicrobiana do probiótico Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019, por meio da técnica do poço, contra 10 micro-organismos podem ser encontrados envolvidos em infecções endodônticas. Além disso, foi avaliado in vivo, por meio da análise microscópica, o efeito desse probiótico quando utilizado como solução irrigadora de canais radiculares de dentes de ratos com lesões periapicais induzidas. Para a análise in vitro, foi feita a atividade antimicrobiana do probiótico sobre os Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lacticaseibacillus casei, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia e Fusobaterium nucleatum. Após 48 a 72 horas de incubação das placas de petri contendo meio de cultura, as cepas dos micro-organismos e o probiótico, as placas foram examinadas para avaliação da uniformidade do crescimento microbiano, presença de contaminantes e do halo de inibição. Após a inspeção visual, a leitura do halo de inibição foi realizada com auxílio de um paquímetro digital utilizando fonte de luz refletida para iluminar a placa invertida sobre um fundo preto e opaco após a remoção da tampa. Desse modo, foram obtidos 3 valores de cada inóculo bacteriano que foram somados e divididos por três para se obter a média dos valores. Já para a avaliação in vivo, os animais foram divididos em seis grupos de acordo com a solução irrigadora utilizada nos canais radiculares após abertura coronária e exposição do tecido pulpar, conforme segue: Grupo I (4 animais/ 8 dentes) dentes hígidos; Grupo II (4 animais/ 4 dentes): Hipoclorito de sódio à 2,5% como solução irrigadora (3 dias); Grupo III (4 animais/4 dentes): Probiótico como solução irrigadora (3 dias); Grupo IV (12 animais/ 24 dentes): Lesão periapical sem nenhum tratamento (7, 21 e 42 dias); Grupo V (12 animais/24 dentes): Hipoclorito de sódio à 2,5% como solução irrigadora (7, 21, 42 dias); Grupo VI (12 animais/24 dentes): Probiótico como solução irrigadora (7, 21, 42 dias). O probiótico Bifidobacterium animalis subsp. lactis (B. lacti) HN019 foi utilizado como solução irrigadora, formulada pela adição do probiótico a 2,7x 109 UFC em meio aquoso, acrescida de 2,0% de carboximetilcelulose, com um volume final de 100mµL. Para a administração local, os canais radiculares foram irrigados no dia 0 e dias 3, 7, 14, 21, 28 e 35 dias após a indução da lesão periapical. Após eutanásia dos animais, as mandíbulas foram submetidas ao processamento histotécnico, as lâminas coradas em hematoxilina e eosina (HE) e analisadas em microscópica óptica para descrição das características do conteúdo do canal radicular e das regiões apical e periapical, paralelamente à análise morfométrica da área das lesões periapicais, em microscopia fluorescente. Foi realizada, ainda, a contagem de osteoclastos, empregando a histoenzimologia para Atividade da Fosfatase Ácida Resistente ao Tartarato (TRAP). Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística por meio diferentes testes de acordo com a natureza dos dados. Para todas as análises foi adotado o nível de significância de 5%. Os resultados do estudo in vitro demonstraram que o probiótico B. animalis subsp. lactis HN019 promoveu a inibição de todas as cepas dos patógenos avaliados, com exceção do Candida albicans, demostrando atividade antimicrobiana sobre esses micro-organismos. Já os resultados do estudo in vivo da análise dos parâmetros histopatológicos demostraram que os grupos III e VI, com probiótico como solução irrigadora, apresentaram melhores resultados quando comparados ao grupo sem tratamento e com a irrigação de hipoclorito de sódio, mostrando menor quantidade de células inflamatórias e menor área da lesão. Em relação ao número de osteoclastos, foi observado diminuição apenas no grupo III, aos 3 dias (p=0,0425), e no grupo VI aos 21 dias (p=0,0043). Após as metodologias e os resultados obtidos, pode-se concluir que o probiótico Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 apresentou in vitro atividade antimicrobiana contra micro-organismos presentes em infecções endodônticas, além de apresentar, microscopicamente, um potencial terapêutico para administração local como solução irrigadora na progressão da lesão periapical, quando comparado ao hipoclorito de sódio.Probiotics are living microorganisms that, when administered in adequate amounts, confer health benefits to the host. Research regarding the use of probiotics to treat diseases in the oral cavity has shown relevant results. However, few studies report the effect of using probiotics on pulp infections and neither in vivo study has used probiotics as an irrigation solution for root canals. Thus, the objective of the present study was to evaluate, in vitro, the antimicrobial activity of the probiotic Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019, using the well technique, against 10 microorganisms that can be found involved in endodontic infections. In addition, it was evaluated in vivo, through microscopic analysis, the effect of this probiotic when used as an irrigation solution for root canals of rat\'s teeth with induced periapical lesions. For in vitro analysis, probiotic antimicrobial activity was performed on Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lacticaseibacillus caseii, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas endodontalis, Prevotella intermedia e Fusobaterium nucleatum. After 48 to 72 hours of incubation of the petri dish containing culture medium, the strains of the microorganisms and the probiotic, the dishes were examined to assess the uniformity of microbial growth, the presence of contaminants and the halo of inhibition. After visual inspection, the inhibition halo was read with the aid of a digital caliper using a reflected light source to illuminate the inverted plate on a black and opaque background after removing the cover. Thus, 3 values of each bacterial inoculum were obtained, which were added and divided by three to obtain the average of the values. For the in vivo evaluation, the animals were divided into six groups according to the irrigating solution used in the root canals after coronary opening and exposure of the pulp tissue, as follows: Group I (4 animals / 8 teeth) healthy teeth; Group II (4 animals / 4 teeth): 2.5% sodium hypochlorite as an irrigating solution (3 days); Group III (4 animals / 4 teeth): Probiotic as an irrigating solution (3 days); Group IV (12 animals / 24 teeth): Periapical lesion without any treatment (7, 21 and 42 days); Group V (12 animals / 24 teeth): 2.5% sodium hypochlorite as an irrigating solution (7, 21, 42 days); Group VI (12 animals / 24 teeth): Probiotic as an irrigating solution (7, 21, 42 days). The probiotic Bifidobacterium animalis subsp. lactis (B. lacti) HN019 was used as an irrigating solution, formulated by adding the probiotic at 2.7x 109 CFU in aqueous medium, plus 2.0% of carboxymethylcellulose, with a final volume of 100mµL. For local administration, the root canals were irrigated on day 0 and days 3, 7, 14, 21, 28 and 35 days after induction of the periapical lesion. After euthanizing the animals, the mandibles were submitted to histotechnical processing, the slides stained in hematoxylin and eosin (HE) and analyzed in optical microscopy to describe the characteristics of the root canal content and the apical and periapical regions, in parallel to the morphometric analysis of the area periapical lesions, under fluorescent microscopy. Osteoclast counting was also performed, using histoenzymology for Tartrate Resistant Acid Phosphatase Activity (TRAP). The results obtained were submitted to statistical analysis through different tests according to the nature of the data. For all analyzes, the significance level of 5% was adopted. The results of the in vitro study demonstrated that the probiotic B. animalis subsp. lactis HN019 promoted the inhibition of all strains of the pathogens evaluated, with the exception of Candida albicans, demonstrating antimicrobial activity on these microorganisms. The results of the in vivo study of the analysis of the histopathological parameters showed that groups III and VI, with probiotic as an irrigating solution, presented better results when compared to the group without treatment and with the irrigation of sodium hypochlorite, showing less inflammatory cells and smaller lesion area. Regarding the number of osteoclasts, a decrease was observed only in group III, at 3 days (p=0.0425), and in group VI at 21 days (p=0.0043). After the methodologies and the results obtained, it can be concluded that the probiotic Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 showed in vitro antimicrobial activity against microorganisms present in endodontic infections, besides presenting, microscopically, a therapeutic potential for local administration as an irrigating solution in the progression of periapical lesion, when compared to sodium hypochlorite