Estudo de genes ancestrais em Marchantia polymorpha

Dissertação de mestrado em Genética MolecularA descrição da história evolutiva das plantas é um desafio devido aos constantes eventos de duplicação genómica que ocorreram ao longo da evolução. Estes eventos aumentam a complexidade do genoma, o que por sua vez aumenta a dificuldade em perceber a função de um determinado gene devido à redundância entre membros da mesma família de genes. A análise da função de um determinado gene em plantas basais é um método que permite perceber a função ancestral de um gene devido à presença de um menor número de cópias no genoma destas plantas. Assim, com o estudo de genes ancestrais é possível perceber como módulos reguladores de genes foram estabelecidos e como evoluíram. O módulo DDR, constituído pelas proteínas DIVARICATA (DIV), RADIALIS (RAD) e DIV-and-RAD-Interacting Factors (DRIF), controla diversos processos de desenvolvimento como por exemplo o estabelecimento da assimetria floral em Antirrhinum majus. Genes homólogos a DIV, DIVARICATA LIKE (DIVL) e DRIF foram encontrados em Marchantia polymorpha, uma planta não vascular que tem vindo a ser reafirmada como planta modelo devido à sua posição filogenética, à implementação de diferentes técnicas e ferramentas moleculares e outras características como o curto ciclo de vida que facilita a transformação e propagação. Nesta dissertação, foi estudada a função ancestral dos genes DIV e DRIF com o objetivo de perceber o papel do módulo DDR em plantas basais e como este módulo foi estabelecido ao longo da evolução. Para obter o padrão de expressão temporal e espacial dos genes MpDIV, MpDIVL e MpDRIF foi realizada uma reação de polimerização em cadeia quantitativa em tempo real (RT-qPCR) e uma hibridização in situ. Fusões GUS::promotor foram iniciadas para confirmar a localização e o nível de expressão destes genes em diferentes tecidos. Linhas knockout para os genes MpDIV1, MpDIV2 e MpDIVL foram desenvolvidas usando a tecnologia CRISPR/Cas9 e linhas de sobrexpressão para os genes MpDIV1 e MpDRIF foram desenvolvidas usando a tecnologia Gateway para obter pistas sobre a função destes genes em M. polymorpha.Exploring the evolutionary path in the plant kingdom is challenging due to the repeated events of duplication that occurred during plant evolution. These events increase the genome complexity, which also increase the difficulty in understanding the function of a given gene due to redundancy within multigene families. The analysis of gene function in early plant species is a process that allows the study of the role of ancestral gene functions due to the existence of fewer gene copies in these plants. Therefore, through the study of ancestral genes is possible to understand the establishment and evolution of regulatory modules. The DDR module, that is constituted by the DIVARICATA (DIV), RADIALIS (RAD) and DIV-and-RAD-Interacting Factors (DRIF) proteins, controls several developmental processes like the flower asymmetry in Antirrhinum majus. DIV, DIVARICATA LIKE (DIVL), and DRIF homologs were found in Marchantia polymorpha, a non-vascular plant reaffirmed as a model species due to its unique phylogenetic position, to the implementation of several different molecular techniques and tools and other characteristics, like the short life cycle that facilitates the transformation and propagation. In this thesis, the ancestral function of DIV and DRIF was studied to understand the role of the DDR module in early plant species and how this module was established during evolution. A real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) and a whole mount in situ were performed to obtain the temporal and spatial expression pattern of MpDIV, MpDIVL and MpDRIF. GUS::promoter fusions were initiated to confirm the localization and the expression level of these genes in different tissues. Knockout lines were developed for MpDIV1, MpDIV2 and MpDIVL using the CRISPR/Cas9 technology and overexpression lines for MpDIV1 and MpDRIF using the Gateway technology to obtain clues about the genes function in M. polymorpha.This work was funded by FEDER funds through the Operational Competitiveness Programme-COMPETE and by National Funds through FCT—Fundação para a Ciência e a Tecnologia under the project PTDC/BIA-PLA/1402/2014, “EvoMod- Origin and Evolutionary establishment of a transcriptional module controlling flower asymmetry”. Work supported by UID/MULTI/04046/2013 centre grant from FCT, Portugal (to BioISI)