Determinazione in tracce di farmaci antinfiammatori non steroidei nel latte bovino mediante HPLC-tandem MS

I farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) trovano un vasto impiego sia in medicina umana che veterinaria per le loro proprietà antiflogistiche, antidolorifiche e antipiretiche e per l’assenza dei seri effetti collaterali di immunosoppressione associati ai cortisonici, l’altra grande classe di antinfiammatori. Già dai primi anni ’70, i FANS sono stati regolarmente utilizzati per la cura di mastiti nei bovini da latte e per lenire il dolore muscolo-scheletrico di equini e bovini. Recentemente, il sospetto di un uso eccessivo di queste sostanze è stato confermato da un’indagine condotta dalla Food Safety Inspection Service, che ne ha messo in luce alti livelli nelle carni degli animali macellati ispezionati. Finora, la Food and Drug Administration non ha approvato l’uso dei FANS per gli animali in produzione zootecnica, mentre la Commissione Europea ha emesso una serie di normative sempre più stringenti per garantire un alto livello di protezione della salute umana. Nell’Unione Europea non si impone l’utilizzo di metodi standardizzati per il controllo dei residui negli alimenti; si richiede invece di sviluppare e validare metodi analitici sulla base di criteri precisi, indicati nella Decisione 657 del 2002, che prevede inoltre l’uso di uno spettrometro di massa come rivelatore cromatografico per analisi di conferma. I FANS agiscono ostacolando la produzione delle prostaglandine, mediatori responsabili di gonfiore e dolore, attraverso l’inibizione delle ciclossigenasi (COX). La prima isoforma, la COX-1, è deputata alla produzione fisiologica di prostaglandine, volte alla protezione della mucosa gastroduodenale; la seconda isoforma, la COX-2, è espressa soprattutto nei siti di infiammazione. Nonostante la grande varietà strutturale, i FANS possono essere classificati in accordo alla selettività per i due isoenzimi in: inibitori COX non-selettivi ed inibitori COX-2 selettivi. L’effetto farmacologico dei FANS è tanto più efficace e sicuro quanto più la loro azione è limitata alla COX-2. In ambito zootecnico, tuttavia, rimane molto diffuso l’uso degli inibitori COX non-selettivi e la loro introduzione negli alimenti dovrebbe essere evitata e comunque controllata. Lo sviluppo di metodi multi-residuali di conferma da impiegare nei Programmi di Sorveglianza Nazionale è auspicato dalla Comunità Europea; ciononostante, il numero di pubblicazioni relative all’analisi multi-residuale dei FANS nel latte è limitato ed i metodi sono caratterizzati da procedure estrattive complicate e poco adatte ad analisi di routine. Scopo di questo lavoro è stato lo sviluppo e la validazione di un metodo analitico, basato sulla cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem, per la determinazione di 15 FANS nel latte bovino, appartenenti al gruppo degli inibitori COX non-selettivi; essi includono derivati degli acidi carbossilici (etodolac, diclofenac, ibuprofene, naprossene, chetoprofene, carprofene, flunixina, 5-OH-flunixina, acido salicilico, tolfenamico, meclofenamico), enolici (meloxicam, fenilbutazone) e anilidi (nimesulide e paracetamolo). Il recupero dei FANS dal latte era articolato in due step: deproteinizzazione/estrazione con acetonitrile e clean-up su cartuccia Oasis HLB. Gli analiti erano separati mediante cromatografia di coppia ionica a fase inversa e rivelati mediante una sorgente electrospray in ionizzazione negativa, selezionando due transizioni SRM (Selected Reaction Monitoring) per confermare l’identità di ciascun analita. L’efficacia della procedura estrattiva e la scelta di adeguati standard interni (acetaminofene-d3 e flunixina-d3) consentiva di correggere l’effetto matrice, verso cui la sorgente electrospray risulta sensibile particolarmente quando si analizzano alimenti con un alto tenore di grasso. Il metodo sviluppato è stato validato secondo la Decisione 2002/657/CE e successiva implementazione. Infine, la praticabilità del metodo era verificata realizzando un monitoraggio su piccola scala: non si sono riscontrati casi di contaminazione, fatta eccezione per il salicilato; la sua presenza non può però essere attribuita con certezza all’uso del farmaco tal quale o come acido acetilsalicico, poiché il salicilato è presente in natura come sistema protettivo delle piante e può quindi essere trasferito con l’alimentazione agli animali