New factors involved in transcription-associated genome instability

Trabajo realizado en el Departamento de Genética de la Facultad de Biología en la Universidad de Sevilla, y en el Departamento de Biología del Genoma del Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), para lograr el grado de Doctor en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica.--Calificación: Sobresaliente Cum LaudeEl mantenimiento de la integridad del DNA y la transmisión fiel de su información a la descendencia es una prioridad para los seres vivos. Al mismo tiempo, la molécula de DNA es el sustrato de numerosas reacciones vitales para la célula, como la replicación o la transcripción, las cuales pueden suponer una fuente de daño cuando se desregulan o entran en conflicto con otros procesos. Esto puede producir alteraciones genéticas que incluyen la pérdida de información, mutaciones y reordenaciones cromosómicas en un proceso conocido como inestabilidad genómica. La transcripción es uno de los procesos centrales en el metabolismo del DNA que puede generar inestabilidad genómica en determinadas circunstancias. La transcripción está acoplada al procesamiento del transcrito y desemboca en la producción de una ribonucleopartícula mensajera (mRNP) apta para ser exportada al citoplasma. Se ha demostrado que la ausencia de determinados factores de ensamblaje de la mRNP produce fallos en la elongación de la transcripción, generalmente asociados a la acumulación de híbridos de DNA:RNA y que pueden dar lugar a colisiones entre las maquinarias de transcripción y replicación, mutaciones y daño en el DNA. Estos híbridos de DNA:RNA se forman cuando el transcrito naciente hibrida con la hebra molde del DNA, dando lugar a un dúplex de DNA:RNA y a una hebra de cadena sencilla de DNA en una estructura conocida como bucle R (R-loop). Si bien estas estructuras se forman naturalmente, la acumulación de R-loops es una marca de inestabilidad genómica. El objetivo de esta tesis es estudiar nuevos factores que puedan generar inestabilidad genómica asociada a híbridos de DNA:RNA mediante defectos en el ensamblaje de la mRNP, así como entender el efecto que tienen la acumulación de R-loops y otras fuentes de daño poco estudiadas, como las roturas de cadena sencilla (SSBs), sobre la transcripción y la propia RNA polimerasa II (RNAPII). Recientemente se ha demostrado que no solo la ausencia de factores de ensamblaje de la mRNP puede generar inestabilidad genómica. Un exceso de la proteína Yra1, que participa en la formación y exportación de la mRNP, es capaz de producir inestabilidad genómica dependiente de R-loops.En un primer capítulo de esta tesis, y empleando Saccharomyces cerevisiae como organismo modelo, buscamos otros genes cuya sobreexpresión pudiera causar inestabilidad genómica asociada a híbridos de DNA:RNA. Para ello, realizamos un escrutinio de sobreexpresión en mutantes hpr1 que acumulan R-loops, identificando aquellos genes cuya sobreexpresión produjera una reducción en el crecimiento como indicativo de un aumento en la cantidad de híbridos de DNA:RNA. Mediante esta aproximación hemos identificado tres proteínas de unión al RNA cuyo exceso produce un aumento de daño en el DNA que es dependiente de R-loops: Dis3, la unidad catalítica esencial del exosoma; She2, implicada en el transporte al citoplasma de ciertos mRNAs; y Rie1, una proteína de unión al RNA de función desconocida. Hemos mostrado que la sobrexpresión de DIS3 posiblemente produce su agregación y por tanto la reducción de los niveles de esta proteína disponibles para formar el exosoma, causando fenotipos similares a los de la pérdida de función de esta proteína: Aumento del daño en el DNA dependiente de híbrido y defectos en el procesamiento del RNA ribosómico. La sobreexpresión de DIS3 da lugar a un ligero aumento de híbridos a nivel global en el núcleo, como sucede en el mutante condicional de dis3, probablemente debido a que el exceso de Dis3 produce una desregulación de la transcripción que conlleva la expresión de RNA aberrantes, antisentido y no codificantes que no son degradados. Por otra parte, la sobreexpresión de SHE2 produce una acumulación de R-loops en genes que codifican para RNAs con estructuras en forma de tallo-lazo (stem-loop), posiblemente porque el exceso de She2 favorece la re-hibridación del transcrito con el DNA, o estabiliza los híbridos de DNA:RNA. Por último, hemos mostrado cómo la sobrexpresión de RIE1 provoca la entrada de su proteína, que es citoplasmática a niveles endógenos, en el núcleo. Aquí, Rie1 produce una fuerte acumulación de R-loops, posiblemente debido a la generación de defectos en el procesamiento de los ARNs de manera directa, por unión a RNA, o bien por mediación de otros factores. En el segundo capítulo de la tesis, hemos diseñado una serie de sistemas moleculares que permiten controlar la expresión del gen LYS2 de la levadura al tiempo que inducimos la formación de R-loops o de cortes de cadena sencilla (SSBs) en dicho gen, permitiéndonos estudiar sus efectos sobre la transcripción. Hemos determinado que la formación de híbridos de DNA:RNA a niveles fisiológicos bloquean transitoriamente el avance de la RNAPII, produciendo una disminución en la tasa de elongación. Esta RNAPII bloqueada podría ser eliminada del DNA, ya que los niveles de transcrito disminuyen en presencia de R-loops y observamos una caída drástica de la cantidad de RNAPII durante cinéticas de elongación. Por otra parte, la inducción de SSBs en la cadena molde (pero no en la cadena no-molde) producen una acumulación de RNAPII corriente arriba del sitio dañado, generando un bloqueo que puede causar la eliminación de la RNAPII del DNA, como sugiere la disminución de transcrito. Finalmente, empleando estos sistemas para inducir la formación de R-loops y SSBs, diseñamos unos sistemas genéticos que nos permiten medir recombinación entre cromosomas homólogos. Gracias a estos sistemas hemos observado que los R-loops son una fuente débil de daño en el DNA en comparación a los SSBs y nos permitirán determinar qué factores son necesarios para los procesos de reparación, transcripción o eliminación de la RNAPII bloqueada por a R-loops o SSBs