Strength in Numbers – Droplet Microfluidics for Multicellular Ensemble Applications

The work presented in this doctoral thesis explores multicellular, biological, and biotechnological applications for microfluidic droplets, making use of a number of unique features of these miniaturized, highly scalable reaction vessels. Droplet microfluidics specializes in pico- to nanoliter sized aqueous droplets in an immiscible oil phase, borrowing techniques from the field of microfluidics, namely fluid actuation, detection systems and electronic peripherals. A lot of these techniques have been made possible by discoveries and inventions originally developed for microelectronics and relate to the fabrication of micrometer scale features. Channels with a width and depth of fractions of a millimeter allow for the reliable and precise manipulation of fluids necessary to achieve high throughput while maintaining accuracy. Many subdisciplines of biological research rely on scale, on strength in numbers, in a sense that only a sufficient number of samples enables insights into the genome, transcriptome, or proteome of an organism, into the heterogeneity of populations, into the efficacy of a prospective drug. Just like some other single-cell analysis techniques, such as flow cytometry, droplet microfluidics facilitates that scale of analysis. However, in addition to this, droplet microfluidics as a technology platform is capable of processing and analyzing multicellular ensembles, or interrogating extracellular traits. This is especially beneficial for biotechnological or pharmaceutical research applications. In Paper I, we investigated the encapsulation of insulin secreting cells in mucin gel beads. The gel protects the cells against a host’s immune system response while allowing for nutrient and gas passage as well as diffusion of the secreted insulin. In Paper II, we present a high-throughput production and analysis workflow for droplet-assisted spheroid formation. We use deep learning to train a model to support the optimization of droplet incubation conditions. The resulting minispheroids enable large-scale 3D cell culture model screening. In Paper III, we developed and characterized a portable, compact droplet generation setup, using exclusively commercially available parts and demonstrated its versatility by dynamically tuning droplet size and composition. Finally, we demonstrated its use for the encapsulation of human primary cells to form spheroids in the sterile environment of a biosafety cabinet. For Paper IV, we developed an integrated fluorescence area sorting approach to sort cell colonies in microfluidic droplets. After validating the sorter, we screened yeast microcolonies in droplets and used averaging over the entire droplet width to ameliorate the impact of cell heterogeneity within isoclonal populations.Det arbete som presenteras i den här doktorsavhandlingen utforskar multicellulära, biologiska och biotekniska tillämpningar för mikrofluidiska droppar och utnyttjar ett antal unika egenskaper hos dessa miniatyriserade reaktionskärl. Droppmikrofluidik använder pico- till nanoliterstora vattendroppar i en oljefas som inte löser vatten, och lånar tekniker från området mikrofluidik, nämligen vätskestyrning, detektionssystem och elektronisk kringutrustning. Många av dessa tekniker har möjliggjorts genom upptäckter och uppfinningar som ursprungligen utvecklades för mikroelektronikproduktion och omfattar tillverkning av strukturer i mikrometerskala. Kanaler med bredd och djup i storleksordningen bråkdelsmillimeter möjliggör den tillförlitliga och exakta hantering av vätskor som krävs för att uppnå hög genomströmning med bibehållen noggrannhet.Många underdiscipliner inom biologisk forskning är beroende av storskaliga analyser, som ger strength in numbers, i den meningen att endast ett tillräckligt stort antal prover ger insikt i en organisms genom, transkriptom eller proteom, i populationers heterogenitet eller i ett framtida läkemedels effektivitet. Precis som vissa andra tekniker för analys av enstaka celler, t.ex. flödescytometri, så möjliggör droppmikrofluidik stora antal analyser. Dessutom kan droppmikrofluidik som teknisk plattform bearbeta och analysera flercelliga ensembler eller undersöka extracellulära egenskaper. Detta är särskilt fördelaktigt för biotekniska eller farmaceutiska forskningstillämpningar. I artikel 1 undersöker vi hur insulinproducerande celler kan kapslas in i mucingel-droppar. Den gel som används kan skydda cellerna, till exempel efter en transplantation, från ett kraftigt immunsvar, samtidigt som den tillåter passage av näringsämnen och gaser samt spridning av utsöndrat insulinet. I artikel II presenterar vi ett arbetsflöde för droppassisterad sfäroidbildning för produktion och analys med hög genomströmning. Vi använder deep learning för att träna en modell som stöd för optimering av inkubationsförhållanden i dropparna. De resulterande minisfäroiderna möjliggör storskalig screening med 3D-cellkulturmodeller. Artikel 3 handlar om utveckling och utvärdering av ett litet och bärbart lågkostnads-instrument med enbart kommersiellt tillgängliga komponenter och visar dess mångsidighet genom att dynamiskt anpassa dropparnas storlek och sammansättning. Slutligen visade vi att instrumentet kan användas för inkapsling av primära mänskliga celler för att bilda sfäroider i ett biosäkerhetsskåp. I artikel 4 använder vi mikrofluidiska droppar för att förbättra biotekniska screening-kampanjer. Vi undersöker mikrokolonier av jäst i stället för enskilda celler i droppar för att mäta ett genomsnittligt värde för flera celler med samma arvsmassa. Detta medelvärde är mer informativt än en mätning av enskilda celler, eftersom det minskar mätvariationen på grund av minimala variationer celler emellan som annars skulle förhindra utsortering av de bästa cellvarianterna.QC 2022-11-21