Heterologous Rhizopus oryzae lipase expressed in Komagataella phaffii : improved production, biochemical characterization and industrial applications

En la presente tesis, se ha estudiado la lipasa 1,3-regioespecífica de Rhizopus oryzae (ROL), mejorando su estabilidad operacional y su producción heteróloga, y se ha probado su capacidad biocatalítica en diferentes reacciones de interés industrial. En lo relativo a la estabilidad operacional, se evaluó el efecto del soporte de inmovilización y sus grupos funcionales en la actividad de la secuencia madura de ROL (rROL) durante la síntesis de biodiesel en un medio de reacción sin solvente (solvent-free) con aceite de orujo como sustrato modelo. Los soportes de polimetacrilato con cadenas hidrocarbonadas mejoraron la estabilidad operacional del biocatalizador permitiendo una mayor vida media. Se estudió también la producción de biodiesel de segunda y tercera generación a partir de aceites vegetales no comestibles, de aceites microbianos y de aceites de fritura usados (WCO), respectivamente. Además, la síntesis de biodiesel a partir de WCO se monitoreó en línea mediante el uso de espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR) en un reactor de escala de laboratorio (50 mL), obteniendo una alternativa exitosa a la cromatografía de gases -la técnica más comúnmente empleada. La estabilidad del biocatalizador también se mejoró mediante la adición de los 28 aminoácidos del extremo C-terminal de la prosecuencia nativa del enzima -que han sido descritos que actúan como chaperona intramolecular- al extremo N terminal de rROL obteniendo proROL. La estabilidad de proROL mejoró sustancialmente tanto libre como inmovilizada en comparación con rROL frente a distintas condiciones de pH, temperatura y solventes orgánicos. Además, se obtuvo 1.25 y 3 veces más estabilidad operacional durante la síntesis solvent-free de biodiesel y la esterificación de butirato de etilo (aroma natural de la piña), respectivamente. La producción heteróloga del enzima se realizó en la levadura metilotrófica Komagataella phaffii (Pichia pastoris) bajo el promotor inducible por metanol de la alcohol oxidasa 1 (PAOX1). La producción de proROL, en lugar de rROL, permitió conseguir un bioproceso con una producción y una productividad volumétrica 5.4 y 4.4 veces superiores, respectivamente, en el caso más extremo. Asimismo, proROL demostró reducir los efectos nocivos de su producción en K. phaffii consiguiendo, a diferencia de con rROL, la expresión de dicha lipasa bajo el promotor constitutivo e independiente de metanol de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (PGAP). Se confirmó así la importancia de los 28 aminoácidos de la prosecuencia en su papel como chaperona intramolecular al mejorar la estabilidad del biocatalizador y su producción heteróloga. También se demostró que estos aminoácidos alteraban la especificidad de sustrato pero no tenían un efecto marcado en la caracterización bioquímica de proROL frente rROL. Este biocatalizador con características mejoradas se probó con éxito en la esterificación de acetato/butirato de isoamilo, con independencia del empleo de un alcohol ramificado y sus potenciales impedimentos estéricos. La producción de butirato de isoamilo -que superó los resultados obtenidos con el acetato de isoamilo- se optimizó y se cambió de escala a un reactor de 150 mL. También se empleó aceite de fusel como sustrato de bajo coste alternativo al alcohol isoamílico y se estudió la especificidad de proROL por los isómeros estructurales 2- y 3-metilbutanol. Finalmente, proROL también se empleó y se comparó con la lipasa 1 de Candida rugosa (CRL1) en la producción de ácido poliláctico (PLA) a partir de ácido láctico (condensación directa) y a partir de lactida (polimerización por apertura de anillo, ROP). proROL superó a CRL1 en ambas reacciones, aunque con independencia de la enzima, únicamente se obtuvo PLA detectable a través de resonancia magnética nuclear (NMR) mediante ROP. En resumen, el estudio realizado en esta tesis, integrando diversas áreas de conocimiento, ha llevado a una mejora de la enzima en estudio facilitando su potencial aplicación industrial.In this thesis, the Rhizopus oryzae 1,3-regiospecific lipase (ROL) has been studied, improving its operational stability and heterologous production, and it has been tested in different reactions of industrial interest. Regarding the operational stability, the effect of the immobilization support and its functional groups on the performance of mature sequence ROL (rROL) during the synthesis of biodiesel in solvent-free reaction with olive pomace oil as a model substrate was assessed. Polymethacrylate supports with surface hydrocarbon chains improved the operational stability of the formed biocatalyst, allowing a longer half-life. The production of second- and third-generation biodiesel from non-edible vegetable oils and from microbial and used cooking oils (WCO), respectively, was also evaluated. In addition, the synthesis of biodiesel from WCO was inline monitored using a near infrared (NIR) spectroscopy probe into a laboratory scale reactor (50 mL), which proved to be a successful alternative to gas chromatography -the most commonly employed technique. The stability of the biocatalyst was also improved by means of adding the 28 amino acids from the C-terminal of the native prosequence of the enzyme -which have been described as acting as an intramolecular chaperone- to the N-terminal of rROL, obtaining proROL. The stability of proROL both free and immobilized was substantially improved compared to rROL against different conditions of pH, temperature and organic solvents. In addition, the former obtained 1.25 and 3 times more operational stability during the solvent-free synthesis of biodiesel and the esterification of ethyl butyrate (natural pineapple flavour), respectively. The heterologous production of the enzyme was carried out in the methylotrophic yeast Komagataella phaffii (Pichia pastoris) under the methanol-inducible promoter of alcohol oxidase 1 (PAOX1). The production of proROL, instead of rROL, enabled the obtention of a bioprocess with increased production and a volumetric productivity, 5.4 and 4.4 times, respectively, in the most extreme case. Likewise, proROL proved to reduce the harmful effects of its production in K. phaffii achieving, unlike with rROL, its constitutive expression under the methanol-independent promoter of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (PGAP). The importance of the 28 amino acids of the prosequence in its role as an intramolecular chaperone by improving the stability of the biocatalyst and its heterologous production was thus confirmed. Besides, these amino acids were proved to alter the substrate specificity of proROL compared to rROL but they had no marked effect on the biochemical characterization of the enzyme. Hence, a biocatalyst with improved characteristics was obtained which satisfactorily catalyzed the isoamyl acetate/butyrate esterification, regardless of the use of a branched alcohol and the potential steric hindrances. Isoamyl butyrate production -whose production exceeded the results obtained for isoamyl acetate- was optimized and scaled up to a 150 mL reactor. Fusel oil was also used as a low-cost alternative substrate to isoamyl alcohol and the specificity of proROL for the structural isomers 2- and 3-methylbutanol was assessed. Finally, proROL was also employed and compared with Candida rugosa lipase 1 (CRL1) in the production of polylactic acid (PLA) from lactic acid (direct condensation) and from lactide (ring-opening polymerization, ROP). proROL outperformed CRL1 in both reactions, although regardless of the enzyme, PLA was only detectable by nuclear magnetic resonance (NMR) in ROP. In summary, the thorough study performed in this thesis, integrating various areas of knowledge, has led to an improvement in the enzyme under research, proROL, boosting its potential as industrial biocatalyst